酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）对瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌影响的研究

作     者：赵庆阳 

作者单位：大连医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦宏智

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：酸性成纤维细胞生长因子 成纤维细胞 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原 

摘      要：目的探讨酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）对体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞（Keloid fibroblast KFB、Normal skin fibroblastNFB）的增殖及I、Ⅲ型胶原蛋白合成的调控作用。 方法选取15例瘢痕疙瘩组织，10例正常皮肤组织，采用组织块法培养瘢痕疙瘩成纤维细胞，两步酶消化法培养正常皮肤成纤维细胞，以瘢痕疙瘩成纤维细胞为实验组，以正常皮肤成纤维细胞为对照组，进行以下研究:（1）采用倒置显微镜观察成纤维细胞形态，透射电镜观察成纤维细胞的超微结构;（2）采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）连续7天检测不同浓度aFGF作用下成纤维细胞的增殖情况，并绘制生长曲线，计算其最佳作用时间;（3）采用免疫组化法检测成纤维细胞增殖细胞核抗原（ProliferatingCellNuclearAntigen， PCNA）的表达情况;（4）通过实时荧光定量PCR测定成纤维细胞I、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达量;（5）通过Western blot法测定细胞中I、Ⅲ型胶原蛋白的表达量;（6）通过检测培养基中胶原蛋白的含量来检测细胞外胶原的分泌量。 结果瘢痕疙瘩组织及正常皮肤组织，均成功培养出成纤维细胞。（1）成纤维细胞形态学比较：瘢痕疙瘩与正常皮肤成纤维细胞均呈长梭形、不规则形，胞质饱满，胞核淡然，呈椭圆形，可见1-2个核仁，生长旺盛;电镜下，瘢痕疙瘩成纤维细胞中有大量的Ⅰ型胶原，高尔基体、核糖体、内质网等细胞器丰富，胞膜表面有细丝状结构，胞外有大量胶原分泌。（2）aFGF对瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞增殖的影响：培养基中加入不同浓度（0、1、10、50、100、500ng/ml）的aFGF培养成纤维细胞7d，可见随着aFGF浓度的增加，细胞增殖速度明显增加，实验组与对照组相比细胞增殖速度较快，细胞增殖率在药物作用第4天后差异显著（p0.05）;免疫组化染色显示PCNA在药物作用第4天后实验组比对照组增殖明显加快（p0.05）。（3）实时荧光定量PCR及Western blot法测定成纤维细胞I、Ⅲ型胶原蛋白mRNA和蛋白表达情况，结果为aFGF低浓度组（1、10ng/ml）对瘢痕疙瘩培养成纤维细胞I型胶原的表达具有促进作用（p0.05），对Ⅲ型胶原蛋白的表达无显著作用，高浓度组（100、500ng/ml）对瘢痕疙瘩成纤维细胞I、Ⅲ型胶原的表达具有显著抑制作用（p0.05）;对正常皮肤成纤维细胞作用表现为，低浓度时对I、Ⅲ型胶原的表达无显著的影响，在高浓度时对I型胶原表达具有显著的抑制作用（p0.05）。（4）检测培养基中胶原蛋白的含量结果与（3）一致。 结论aFGF对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞在低浓度时具有明显的促进增殖作用， I型胶原的表达量增加;在高浓度时对其I、Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白表达具有显著的抑制作用。aFGF对体外培养的人正常皮肤成纤维细胞仅在高浓度时对I型胶原蛋白的表达具有显著的抑制作用。提示我们在保留瘢痕疙瘩组织的情况下，小剂量应用aFGF具有促进切口愈合的作用，并提高切口愈合质量。