过度牵伸载荷所致钙超载/细胞骨架损伤在肌腱病中的作用及其机制

作     者：邓银栓 

作者单位：第三军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐康来

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：肌腱细胞 过度机械载荷 钙离子 细胞骨架 钙化性肌腱病 

摘      要：研究背景 肌腱病(tendinopathy)不但是一种职业病，也是最常见的运动损伤性疾病，发病率高，是目前骨科学和运动医学主要的伤病之一。大量研究表明：过度牵伸载荷导致肌腱的微损伤及不成熟的修复是其发生的直接原因，病理表现为腱变性、细胞外基质增加、胶原排列紊乱、肌腱内血管不规则增生、钙化、骨化及止点唇样增生。众所周知人体各种形式的运动都是由肌肉收缩通过肌腱、韧带带动骨、关节运动而实现的，肌腱在体内不断承受各种动态的力学刺激，力学刺激可引起肌腱结构的重塑和细胞生物学行为的改变，最终导致肌腱生理或者病理变化，在力学刺激的传递、转化过程中，各种信号分子发挥着重要作用，其中钙离子作为第二信使，能将机械信号转化为细胞内生物化学信号引起一系列的生理或者病理过程，同时细胞骨架也是力学传递、信号转导的重要结构，因此，对肌腱细胞内钙离子及细胞骨架在响应力学刺激时的作用及机制研究，已经成为当前运动医学、骨科学的热点。 我们假设：过度的机械载荷能导致细胞内钙超载和造成细胞骨架的损伤，激活细胞膜上的钙通道，诱导细胞外钙内流和细胞内钙浓度增加，使细胞内钙超载，最终导致肌腱内钙盐沉积，使肌腱发生钙化。 我们前期已成功分离了人肌腱细胞，建立了肌腱细胞体外牵拉模型，本实验拟应用肌腱细胞体外牵拉模型，采用不同的钙通道抑制剂及外源性钙对人肌腱细胞进行干预，利用免疫荧光技术和激光共聚焦显微镜对比观察过度牵伸载荷与非过度载荷条件下细胞内钙超载及细胞骨架F-actin的变化情况，验证过度牵伸载荷能否诱导体外人肌腱细胞内钙超载及细胞骨架损伤，为肌腱病的发病机制提供理论依据。 研究目的 模拟体内肌腱细胞平行排列方式及受力情况，应用肌腱细胞体外循环过度牵拉模型，结合免疫荧光技术及激光共聚焦显微镜观察体外人肌腱细胞内钙离子、细胞骨架在过度牵伸条件下的变化，初步探讨Ca2+超载、细胞骨架损伤在过度牵伸载荷所致肌腱病中的作用及细胞内钙超载的机制，阐明肌腱病的可能发生机制，为进一步防治肌腱病提供新思路。 方法 一、人肌腱细胞的分离培养鉴定及牵拉有效性评价 1.人肌腱细胞分离、原代培养及鉴定 采用酶消化法在无菌条件下取手术中废弃的肌腱组织进行细胞分离及原代培养，取第二代细胞采用免疫荧光染色—激光共聚焦显微镜技术观察I、III型胶原和波形蛋白(Vimentin)表达情况，进行细胞表型鉴定。 2．人肌腱细胞牵拉有效性评价 设置牵伸频率1.0Hz;强度4%、8%、12%;时间12h;以同等条件下未牵拉细胞为对照组，不施加应力。分别应用免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜、倒置光显微镜观察微沟槽硅树脂培养皿上的细胞形态，对比牵伸组与非牵伸组细胞在微沟槽硅树脂培养皿上是否脱落，漂浮及其排列方式。 二、不同牵伸载荷诱导体外人肌腱细胞Ca2+超载及其机制 1.不同牵伸载荷诱导细胞内钙超载的免疫荧光分析 设置牵伸频率：0.5Hz;牵伸强度分别为：4%、8%、12%;牵伸时间分别为：4、8、12h;共分12组。同时，以同等条件下的细胞设置为对照组，不施加应力。各实验组细胞牵伸结束后采用Flou-3/AM钙探针负载，激光共聚焦显微镜进行图像采集，每组取100个细胞计算其荧光强度,并取其均值以平均荧光强度反映细胞内钙离子[Ca2+]i的相对水平。 2.细胞外钙螯合剂、钙抑制剂对钙超载的影响 设置牵伸频率为：0.5Hz;牵伸强度8%;牵伸时间4h，分别以含1mol/L、0.5mol/L的Mncl;1mmol/L及0.5mmol/L EGTA(乙二醇双四乙酸);100ug/L及50ug/L的肝素;20mM及40mM硝苯地平及20uM、40uM及80uM三氟甲基吩噻嗪的培养基对接种于微沟槽硅树脂培养皿上生长24h后的人肌腱细胞进行牵拉，以不添加抑制剂(牵伸条件相同)为对照组，各实验组细胞牵伸结束后采用Flou-3/AM钙探针负载，激光共聚焦显微镜采图，每组取50个细胞计算其荧光强度,并取其均值,以平均荧光强度反映肌腱细胞内钙离子[Ca2+] i的相对水平。 3.机械牵伸能诱导人肌腱细胞外钙内流 分别取3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L含钙培养基3ml加入已在微沟槽硅树脂培养皿上生长24h的人肌腱细胞中，其中，一组置于37℃含5%CO2培养箱中静置培养4h，另一组安装于细胞牵拉系统中，设置牵拉强度为8%;时间：4h;频率0.5Hz进行牵拉，牵拉结束后，各组细胞采用Flou-3/AM钙探针负载，激光共聚焦显微镜采图。 三、不同牵伸载荷及钙超载对人肌腱细胞骨架的影响 1.循环牵伸载荷可诱导人肌腱细胞骨架F-actin的损伤： 将接种于微沟槽硅树脂培养皿上的人肌腱细胞置于37℃含5%CO2培养箱中静置培养24h，设置牵伸强度分别为：4%、8%、12%;时间：4、8、12、24h;频率：0.5Hz、1.0Hz。采