基于液质联用技术的酸枣仁多组分分析与体外代谢研究及连翘心质量标准的建立

作     者：张巧月 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张兰桐

授予年度：2016年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：酸枣仁 含量测定 斯皮诺素 连翘心 质量标准 高效液相色谱串联质谱 超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱 

摘      要：酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba ***(Bunge)Hu ex ***的干燥成熟种子,味甘、酸,性平,具有养肝、宁心、安神、敛汗之功能,用于虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴等症,为传统的镇静安神良药。中药多组分测定有助于全面控制药材质量,本研究采用HPLCMS/MS法同时测定酸枣仁药材中9种化学成分,为酸枣仁药材的质量控制提供科学依据。同时,建立人肝微粒体体外温孵模型,应用UHPLC-Q-TOF-MS法鉴定斯皮诺素在人肝微粒体中的代谢产物,推测产物结构及裂解途径,为斯皮诺素的药物代谢研究提供理论支持。此外,利用FDA推荐的特异性探针底物研究斯皮诺素对人肝微粒体细胞色素P450酶7种亚型的抑制作用,评估在体外代谢体系中斯皮诺素对CYP450酶的抑制程度,从而预测其在体内可能引发的药物代谢相互作用,为临床安全用药提供相关信息。连翘心为木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥成熟种子,用于治疗高热烦躁、神昏谵语、夜不安眠等症。本研究制订了连翘心的质量标准,从性状、鉴别(显微和薄层)、检查(水分、灰分和浸出物)、含量测定(挥发油和连翘酯苷A)等方面对连翘心的质量进行了全面监控。同时,建立HPLC-MS/MS法同时测定连翘心药材中8种化学成分的含量,为连翘心药材的质量控制及开发应用提供参考。第一部分HPLC-MS法同时测定酸枣仁中9种化学成分的含量目的:建立HPLC-MS/MS法同时测定酸枣仁中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素、白桦脂酸、白桦脂醇、芦丁、芹菜素、橙皮苷和柚皮苷的含量。方法:采用Sapphire C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm),以水(1 mmol·L-1乙酸铵-0.1%的甲酸)-乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,体积流量1mL·min-1,进样量10μL,柱温30℃;采用电喷雾离子源进行负离子模式监测,多反应监测模式(mrm)用于定量分析,源喷射电压为-4500v,离子源温度为650℃。结果:9种成分的峰面积和质量浓度在测定的质量浓度范围内均具有良好的线性关系,加样回收率为98.0%-101.5%,精密度rsd值为0.03%-0.74%。结论:本法简便、快速、灵敏度高、专属性好,可用于酸枣仁中9种化学成分的测定。第二部分斯皮诺素在人肝微粒体中的代谢研究目的:建立人肝微粒体体外孵育模型,利用uhplc-q-tof-ms法,对斯皮诺素在人肝微粒体中的代谢产物进行鉴定。方法:采用poroshell120ec-c18色谱柱(2.1×100mm,2.7μm),以乙腈-0.1%乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,流速为300μl·min-1;进样量3μl。采用负离子模式进行监测,电喷雾离子源,源温度为550℃,质量扫描范围为m/z100-1000。结果:共鉴定出斯皮诺素在人肝微粒体中的8个代谢产物,并对esi-ms负离子模式下斯皮诺素可能的裂解途径进行了推测,未能检测到葡萄糖醛酸化代谢产物。结论:本研究应用uhplc-q-tof-ms法测定斯皮诺素在人肝微粒体中的代谢产物,方法简便、快速。第三部分斯皮诺素对人肝微粒体p450酶的抑制作用目的:建立uhplc-q-tof-ms法研究斯皮诺素对人肝微粒体细胞色素p450酶7种亚型(cyp1a1、cyp2b6、cyp2c8、cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6和cyp3a4)的体外抑制作用。方法:采用esi正离子检测模式测定7种探针底物代谢物(他克宁1-羟化、安非他酮-羟化、阿莫地喹n-脱乙基、双氯芬酸4 -羟化、s-美芬妥英4 -羟化、右美沙芬o-脱甲基和咪达唑仑1-羟化)的生成量,计算ic50值,分别代表7种酶的代谢活性。结果:斯皮诺素对人肝微粒体cyp1a1、cyp2b6、cyp2c8、cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6和cyp3a4无抑制作用,其ic50值分别为1714μmol·l-1、1158μmol·l-1、226.1μmol·l-1、2288μmol·l-1、80.59μmol·l-1、101.1μmol·l-1和1119μmol·l-1。结论:该分析方法灵敏、准确、可靠,斯皮诺素对人肝微粒P450酶的7种亚型无抑制作用,代谢性药物相互作用发生的可能性较小。第四部分连翘心质量标准的研究目的:研究并建立连翘心的质量标准,为不同来源的连翘心提供质量控制依据。方法:参照连翘的质量标准并结合连翘心的特点,从性状、鉴别、检查、含量测定等方面制定连翘心的质量标准。结果:建立了连翘心的质量标准。结论:连翘心质量标准的建立,有助于其进行质量控制,并为相关标准的建立提供依据。第五部分HPLC-MS法同时测定连翘心中8种化学成分的含量目的:建立HPLC-MS/MS法同时