基于β-葡萄糖醛酸苷酶结构解析的耐热性研究

作     者：汤恒 

作者单位：石河子大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李春

授予年度：2015年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070303[理学-有机化学] 0703[理学-化学] 

主      题：β-葡萄糖醛酸苷酶 晶体结构 分子模拟 蛋白质稳定性 理性设计 同源比对 B-factor 底物选择性 Octopus Loop Binding-Loop 

摘      要：大肠杆菌表达的重组产紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)具有特异性识别并催化甘草酸(GL)的糖苷键水解,生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)及甘草次酸(GA)的优良性能。但是该酶的热稳定性较差,不能满足进一步放大的工业生产需要。本文在深刻理解其催化机理和晶体结构的基础上,运用多种模拟分析软件辅助,按照从外到内,由点到片段的设计顺序,构建了34个突变体酶,提高了PGUS-E的热稳定性。并通过对酶活性中心附近一段特殊的片段进行研究,改变了底物选择性,对进一步研究β-葡萄糖醛酸苷酶结构与功能之间的关系提供了新思路。主要研究结果如下:(1)PGUS-E点突变体的构建及酶学性质分析采用同源序列比对策略,结合定点突变技术,对重组产紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)进行理性设计,成功构建了10个点突变体,获得了3个热稳定性明显提高的突变体,Mutant 13、Mutant 15和Mutant 16在65°C下的半衰期T1/2分别比PGUS-E的15.5 min提高了6倍,1.25倍和4.5倍,达到93 min,19.5 min和70.5min。结果表明在蛋白质对应位置引入嗜热菌的氨基酸,特别是在蛋白质活性中心附近引入疏水氨基酸,可有效提高蛋白质热稳定性。(2)PGUS-E片段突变体的构建及酶学性质分析以PDB和CAZy数据库为基础,利用PYMOL软件进行分析,结合自编脚本和B-factor表征,对糖苷酶家族2中晶体结构进行归类分析,获得了9条高稳定性的Octopus Loop。基于对PGUS-E晶体结构的分析,确定了三个极不稳定的Loop区,结合平末端连接的方法,将获得的高稳定性的Octopus Loop分别引入PGUS-E的不稳定的区域。成功构建了10个片段突变体,其中Mutant 19、Mutant 21和Mutant 26在70°C下的半衰期T1/2分别比PGUS-E的8.5 min提高了3.2倍,11.8倍和9.4倍,达到27.8 min,100.8 min和80.4 min。突变体的动力学参数Kcat/Km与原始酶接近,表明在蛋白质表面合适位置利用高稳定性的Loop替换的稳定的Loop不仅可以提高热定型,还可保持其催化效率不发生大的变化。(3)PGUS-E底物选择性的研究通过对PGUS-E与底物的晶体复合物结构解析发现在活性中心附近存在一段柔性极高的Loop与底物结合有关,将其命名为Binding-Loop。利用SWISS-MODEL和PEP-FOLD进行在线同源建模,获得具有相似催化特性的酶At GUS,Au GUS和TM1062的结构并与PGUS-E进行比对,结果表明该Loop区域的差异最大,且PGUS-E的Binding-Loop最长,TM1062的最小。据此结合平末端连接技术对PGUS-E的Binding-Loop进行替换。成功构建了3个Binding-Loop区突变体Mutant 4、Mutant 7和Mutant 31,相对于PGUS-E,3个突变体的对于GL的催化能力几乎完全丧失,而截除突变体Mutant 4对PNPG和GAMG的催化能力下降了一半;短环替换突变体Mutant 7丧失了对PNPG的催化能力的同时保留了催化GAMG的能力;长环替换突变体Mutant 26则相对完全的保留了催化PNPG和GAMG的能力。该结果表明,Binding-Loop对于PGUS-E的底物选择性有着重要影响,通过调整该Loop的序列以及长度就可调整酶对于不同大小底物的催化能力。