普通小麦春化基因VRN3的克隆及表达特性分析
作者单位：河南农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：卫丽
授予年度：2013年
摘 要：为全面了解普通小麦春化基因VRN3的序列特征及表达特性,本研究采用PCR技术分别扩增了8个不同春化特性品种VRN3基因在A、B、D基因组的基因序列;利用RT-PCR并结合RACE扩增克隆了春性品种辽春10号、新春2号和冬性品种京841 VRN-B3、VRN-D3的c DNA全长;利用site-finding PCR技术克隆了VRN-B3、VRN-D3启动子区域的部分序列;并分析和比较了不同发育特性小麦品种中VRN3基因的序列特征和差异。采用Real-time PCR方法对VRN3基因及主要春化基因VRN1、VRN2在小麦生长过程中的表达特性进行了系统的研究。主要研究结果如下:1.以8个春化发育特性不同的普通小麦为试验材料,在基因组和c DNA上扩增VRN3基因,结果显示VRN3在8个品种的基因组中均存在3种序列;结合NCBI(http://***/)上的参考序列(Genbank accession numbers EF428115.1,DQ890164.1,EF428113.1)和扩增得到的c DNA序列进行分析表明:基因组扩增得到的三种序列分别为VRN-A3、VRN-B3、VRN-D3,分别包含2个内含子和3个外显子,三个部分同源序列的外显子差异较小,只有少数单碱基突变,主要差异在第一内含子和第二内含子上,可根据内含子长度的差异来区分VRN3基因组上的3个部分同源序列。2.利用RACE技术克隆了春性品种辽春10号VRN3基因2个部分同源的c DNA全长序列,结合基因组扩增结果,这两个序列分别为VRN-B3、VRN-D3。序列分析显示:其c DNA全长分别为1253 bp和1248 bp,5’UTR分别为129 bp和123 bp,3’UTR分别为593 bp和591 bp,ORF均为534 bp,编码177个氨基酸。VRN-B3和VRN-D3在编码区有11个单碱基的差异,而在5’UTR和3’UTR区有明显的差异。相对于VRN-D3,VRN-B3在5’UTR有9个单碱基差异,还有一段9 bp的插入和3 bp的缺失;在3’UTR区VRN-B3与VRN-D3之间有21个单碱基变异,和4个插入缺失差异。根据VRN-B3、VRN-D3的5’UTR区的差异序列分别设计可特异性扩增VRN-B3和VRN-D3的引物,从辽春10,新春2号和京841 3个不同春化特性的小麦品种c DNA中分别克隆得到了VRN-B3和VRN-D3两个同源基因的c DNA序列,通过不同品种的VRN3 c DNA序列比对,除京841的VRN-D3在c DNA编码框内有一A碱基的变异成T,不同品种间VRN-B3和VRN-D3基因序列保守性很高。***-A3、VRN-B3和VRN-D3氨基酸序列比对结果显示:VRN-A3的部分氨基酸序列与VRN-B3和VRN-D3对应的氨基酸序列完全一致,而全长的VRN-B3和VRN-D3氨基酸序列仅仅在第23位有一个氨基酸差异,VRN-B3为缬氨酸(Val)而VRN-D3为异亮氨酸(Ile)。根据蛋白质结构预测和功能分析结果表明,这一变异不在蛋白质功能结构PBP功能域内。4.利用实时定量RT-PCR方法分析了不同春化特性小麦品种在不同春化处理条件下VRN3与VRN1、VRN2三个主要春化基因的表达特性。结果表明:在春化条件下,三个主要的VRN基因在不同品种中表达趋势非常相似,春化可以促进VRN1基因的表达,抑制VRN2基因的表达,而VRN3基因则在无VRN2抑制的长日照下,随着植株的发育,表达量逐渐增加;在未春化处理条件下,3个春化基因在春性小麦与冬性小麦的表达趋势不同,春性小麦中VRN1基因从植株三叶期开始表达量逐渐增加,而VRN2的表达量受到抑制而不再表达,VRN3基因表达量则逐渐增加;冬性小麦中VRN1,VRN3基本不表达,而VRN2则持续高量表达。5.利用实时定量RT-PCR方法分析了VRN-B3、VRN-D3与VRN3基因表达量的关系。结果表明:在小麦不同生长时期,冬性和春性小麦品种中VRN-B3的表达量均显著高于VRN-D3基因;而VRN-B3与VRN-D3表达量的总和基本与VRN3基因总体表达量持平,据此推测VRN-A3基因可能被沉默而不表达,还需要进一步验证。6.利用site-finding PCR技术对辽春10号的VRN3基因启动子部分进行克隆,最终得到了VRN-B3与VRN-D3基因启动子区的部分序列,序列比对显示VRN-B3与VRN-D3启动子区差异比较大,这些差异是否造成VRN-B3与VRN-D3的表达量不同还有待进一步研究。不同品种之间,VRN-B3的启动子序列也非常保守。综合分析,不同春化特性品种间VRN3基因具有高度的保守性。
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