神经母细胞瘤中DKK3基因启动子甲基化及其表达失活的研究

作     者：王朝林 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈琦

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：NB DKK3 神经母细胞瘤 甲基化 Wnt通路 5-氮杂胞苷 

摘      要：背景与目的 神经母细胞瘤是是婴幼儿最常见的肿瘤。有将近一半的神经母细胞瘤发生在2岁以内的婴幼儿。目前关于神经母细胞瘤真正的病因尚不清楚,一些遗传易感因素被发现与神经母细胞瘤的发病相关。近年来研究发现,一些抑癌基因其DNA序列完整并未发现有基因突变、基因缺失等一系列变化,随后逐渐认识到表观遗传学的改变,尤其是DNA甲基化状况,其参与了肿瘤的发生与发展这一事件。DNA甲基化是可逆的并且可以在一些去甲基化药物的作用下,逆转抑癌基因启动子区域的甲基化状态并恢复其功能,从而抑制肿瘤生长。现在存在两种去甲基化药物:5-氮杂胞苷,即5-azaC,以及5-氮杂脱氧胞苷,即5-aza CdR。5-aza C是去甲基化药物的一种,在DNA复制过程中,其与甲基转移酶结合,并且形成共价复合物,重新表达因甲基化而失活的抑癌基因,并使其恢复功能,起到抑制肿瘤细胞生长的作用。现阶段的研究表明DKK3基因是一个新发现的候选抑癌基因,可以拮抗Wnt信号传导通路子,DKK3基因属于Dickkopf家族的一员,与Wnt受体复合体竞争性结合并且选择性抑制Wnt信号通路,使其失活,进而沉默拮抗基因,使其失去对通路的抑制作用进而导致细胞无限增殖,引发肿瘤。研究表明,DKK3基因启动子区富含CpG岛,以及DKK3基因启动子区的高度甲基化,是导致DKK3基因表达失活的重要原因,目前许多的肿瘤细胞系或恶性肿瘤组织,如胃癌、食管癌、大肠癌,以及前列腺癌、乳腺癌及肺癌等组织中缺失或表达下调,但在神经母细胞瘤中dkk3基因启动子甲基化,以及转录表达状况,5-azac对神经母细胞瘤细胞nb-1细胞增殖及dkk3基因的影响国内外尚无文献报道。因此我们运用半定量rt-pcr、甲基化聚合酶链反应,分别从rna水平检测dkk3基因mrna在nb及对应的神经母细胞瘤瘤旁组织tac中的转录情况,从dna水平检测dkk3基因启动子区域甲基化在nb及对应癌旁组织tac中启动子甲基化状况并分析它们与临床病理特征及分期的关系,随后采用甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-azac)对神经母细胞瘤nb-1细胞株进行干预,探讨dkk3基因在神经母细胞中表达失活的机制,5-azac对nb-1细胞株生长增殖及其dkk3基因表达的影响,从而测定dkk3基因是否是神经母细胞的候选抑癌基因,寻找肿瘤治疗的新靶点。材料与方法1.采用半定量rt-pcr,从rna水平检测dkk3基因在51例nb及tac组织中的转录情况,采用甲基化聚合酶链反应(msp),从dna分子水平测定在nb以及tac组织中dkk3基因启动子的甲基化情况,分析其在临床上的关系。2.经2、5、10、20、50、100、200、400μmol/l的5-azac处理神经母细胞瘤tpc-1细胞后,并采用mtt观察其对细胞生长的作用;应用rt-pcr技术,甲基化特异性pcr,测定细胞经5-azac(5、10、20、50μmol/l)处理后,dkk3基因dkk3基因启动子甲基化状态以及mrna的表达。3.进行统计分析,应用spss10.0统计软件,数据处理:两样本率比较应用四格表的x2检验;两样本定量资料采用t检验,以p0.05为差异显著性的标准;多样本均数的比较,采用单因素方差分析的方法。结果1.在nb中,dkk3基因mrna表达的阳性率分别为100%和43.4%,在tac组织中,没有出现dkk3基因启动子的甲基化的状况,nb组织中38.8%出现dkk3基因启动子甲基化状况,表示2组差异存在统计学意义(p0.05);nb中dkk3基因启动子的甲基化及mrna的表达与患者的病理学分级有明显相关性(p0.05)。***3基因启动子的甲基化在神经母细胞瘤中的表达,与其mrna表达呈现明显的负相关性(P0.05)3.经不同浓度5-azaC处理NB-1细胞后,随着药物作用时间的延长和药物浓度的增加,细胞的生长受到明显抑制,呈时间和剂量依赖性(P0.05);经5、10、20、50μmol/L药物浓度的5-azaC处理NB-1细胞48h后,DKK3mRNA的相对表达量依次为0.199±0.015、0.348±0.009、0.457±0.016、0601±0.010,表达强度与5-azaC药物浓度呈剂量依赖关系(F=370.356,P0.01);MSP检测结果显示,经5-azaC处理后,DKK3基因启动子高甲基化的区域发生部分去甲基化(Fm=295.342,Fum=189.148;P0.05)。结论***3基因启动子区域的甲基化是DKK3基因失活的重要机制,在NB的发生、发展中起着重要作用。2.5-azaC能有效逆转神经母细胞瘤NB-1中DKK3基因的异常甲基化,从而增强DKK3基因表达,抑制肿瘤细胞生长。