利用原生质技术选育耐氧德氏乳杆菌菌株的研究

作     者：李丽 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：付瑞燕

授予年度：2012年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：原生质体转化 单亲灭活 原生质体融合 德氏乳杆菌 乳酸乳球菌 耐氧性能 

摘      要：原生质体技术已成为工业微生物育种的有效手段,包括原生质体转化育种、原生质体融合育种、原生质体诱变育种、原生质体再生育种及其他原生质体育种等。本文利用原生质体转化和单亲灭活原生质体融合技术选育耐氧性能提高的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株,其结果如下： 起始菌株德氏乳杆菌FQ菌株是革兰氏阳性菌,细胞壁致密,所以在原生质体的制备过程中,采用质量浓度适合的溶菌酶和变溶菌素共同作用。酶浓度、酶解时间和酶解方式会影响原生质体的形成和再生,因此,本文采用不同质量浓度的溶菌酶和变溶菌素在37℃下恒温酶解及超声处理德氏乳杆菌FQ菌株,其原生质体的形成率和再生率随着变溶菌素质量浓度的增加而逐渐增大,当变溶菌素和溶菌酶终质量浓度分别为10μg/mL和1mg/mL和超声酶解120min时,形成率和再生率的乘积最大,形成率和再生率分别为99.99%和4.93%,酶浓度过高原生质体的再生率反而降低。用最适酶质量浓度为10μg/mL变溶菌素和1mg/mL溶菌酶,在37℃下恒温酶解并超声处理30min、60min、90min、120min,结果表明：原生质体形成率为99.99%,没有随酶解时间的增加而增大;处理90min,达到最大再生率6.36%。因此,德氏乳杆菌FQ菌株原生质体再生的最适条件为：10μg/mL变溶菌素和1mg/mL溶菌酶,在37℃下恒温酶解并超声处理90min。再生培养基的组成是影响原生质体再生的关键因素,六种双层再生培养基中,双层再生培养基Ⅱ(RM Ⅱ)是德氏乳杆菌FQ菌株原生质体的最适再生培养基,再生率可达到10.59%,再生率大小为：RMⅡRM ⅠRMⅢRMⅣ,而RM Ⅴ和RMⅥ上原生质体不能再生。 为获得耐氧型德氏乳杆菌,本文利用原生质体转化技术将乳酸乳球菌FC菌株的质粒pFL010及其对照菌株乳酸乳球菌FL菌株的质粒pNZ8148转入德氏乳杆菌FQ菌株,结果表明：37℃下,在含有10μg/mL变溶菌素和1mg/mL溶菌酶溶液中超声处理90min制备德氏乳杆菌FQ菌株原生质体,在PEG6000400g/L、转化温度20℃、转化时间5min的条件下进行原生质体转化,连续传5代,得到两株转化子,分别命名为QC和QL。转化子Qc和QL静置培养下的细胞密度均高于德氏乳杆菌FQ菌株静置培养下的细胞密度,表明两株转化子的耐氧性能得到一定的改善。但是,两株转化子静置培养所得的细胞密度均高于摇床培养所得到的细胞密度,表明环境中氧浓度过高对其生长仍然不利。 利用单亲灭活原生质体融合技术对德氏乳杆菌FQ菌株和乳酸乳球菌FC菌株、乳酸乳球菌FL菌株的灭活原生质体进行融合,考察原生质体制备、再生和融合条件的影响因素。结果表明,制备德氏乳杆菌FQ菌株原生质体最适条件为：37℃下,在含有10μg/mL变溶菌素和1mg/mL溶菌酶溶液中超声处理90min。乳酸乳球菌FC菌株添加0.5mg/mL甘氨酸处理后,用终质量浓度为50mg/mL溶菌酶液37℃恒温酶解处理8h,在此条件下原生质体形成率为99.96%。乳酸乳球菌FC菌株原生质体温度灭活最适条件为65℃,灭活时间120min,灭活率为99.99%。德氏乳杆菌FQ菌株和乳酸乳球菌FC菌株最适融合条件为：融合温度为20℃,融合时间为10min, PEG6000400g/L,此条件下可得到最大的融合率1.178×10-5,相比同类研究的文献单亲灭活融合率2.74×10-7,融合率提高43倍左右。连续传5代,得到1株融合子,命名为QC10,在摇床培养方式下其细胞密度可达到6.533,可见融合子QC10的耐氧性能得到了显著的改善。 乳酸乳球菌FL菌株添加1mg/mL甘氨酸处理后,用10mg/mL溶菌酶37℃恒温酶解90min,原生质体形成率可达99.97%。65℃处理乳酸乳球菌FL菌株原生质体120min,原生质体灭活率可达96.89%。融合试验结果表明,在PEG6000400g/L、融合时间5min、融合温度20℃、pH6.5的条件下促融,德氏乳杆菌FQ菌株和乳酸乳球菌FL菌株原生质体的融合率可达2.72×10-6,相比同类研究的文献单亲灭活融合率2.74×10-7,融合率提高10倍左右。连续传5代,得到1株融合子,命名为QL10,其在静置培养方式下细胞密度可达到1.396,相比于亲本德氏乳杆菌FQ菌株细胞密度提高了0.25倍。