基于“有故无殒”思想的大黄对肾脏保护与损伤双向作用的研究
作者单位：昆明理工大学
学位级别：硕士
导师姓名：李宝才;肖小河
授予年度：2012年
学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床]
摘 要：近年来,中药不良反应报道引起了社会对中药安全性的担忧,也为中医药走向国际蒙上了一层阴影。大黄是我国四大常用中药之一,广泛用于胃肠道疾病、肾炎、肝炎、肥胖症等,但曾一度被国外热炒有肝肾毒性和潜在的致癌性,大黄及相关中成药临床应用的安全性受到质疑。 本研究以《黄帝内经·素问》“有故无殒思想为指导,针对大黄保护肾脏和肾毒性的双向作用,尝试建立基于病证毒理学的大黄安全性评价模式和方法,即不仅采用正常动物,同时与疾病动物(4种急性肾衰竭模型)对比研究的方式,综合比较大黄不同提取部位对不同动物模型的干预作用和规律,以期在整体动物水平阐明大黄治疗肾衰的“毒-效-物-病关系,客观评价大黄的肾毒性及其保护肾功能的客观真实性,初步阐明其对不同肾衰模型保护作用的物质基础及其可能的机制,为大黄临床治疗肾病提供合理用药建议,为诠释中医辨证(病)用药减毒的科学性和可行性提供依据,也为丰富和发展中药毒性理论提供新视角和思路。主要研究结果如下： 1.大黄不同提取部位的制备：以掌叶大黄Rheum palmatum L为研究对象,用60%乙醇提取制备大黄总提物(total extract of rhubarb, TR),采用D-101大孔树脂分离得到总蒽醌部位(total anthraquinones, TA)、总鞣质部位(total tannins,TT)以及其他部位(residure components, RC),收率分别为41.2%、6.73%、26.1%和5.92%。利用超高效液相色谱法和紫外-可见光分光光度法分别测定大黄不同提取部位中5种葸醌单体含量以及总葸醌、总鞣质含量,结果表明大黄中葸醌和鞣质类成分被有效分离,其中TA对葸醌成分的转移率大于93.0%,总蒽醌/总鞣质比值超过33.6倍;TT中总鞣质/总葸醌比值超过134.1倍;而RC中残留葸醌和鞣质分别相当于总提物中初始量的0.80%和0.54%。 2.基于正常大鼠的大黄肾毒性评价：将大黄总提物及各成分部位按相同生药量(3g/kg)灌胃给药正常大鼠,每天给药1次,连续7天,各组均未见死亡现象。相对于空白组,TR组大鼠肾功能指标SUN值显著升高(p0.01);TA组SUN和CREA值均显著升高(p0.05,p0.01),血Na值显著降低(p0.01);TT组血Na和C1均显著升高(p0.05,p0.01),血K显著降低(p0.01);RC组各生化指标无显著变化。另外,TR和TA组大鼠的肾小管上皮细胞出现颗粒样变性,TT和RC组无明显病理改变。 3.基于模型动物的大黄肾保护作用和肾毒性评价： (1)大黄不同部位对肾小管S1段损伤的急性肾衰模型的作用：采用与前述正常动物毒性试验相同的给药剂量,分别灌胃给予大黄总提物和各成分部位共7天,实验第4天皮下注射重铬酸钾(20mg/Kg)复制肾小管S1段损伤的急性肾功能衰竭大鼠模型,至实验终点,模型组、TA组、RC组死亡3/8只,TR组死亡4/8只,TT组死亡1/8只。与模型组比较,TT组大鼠的肾功能指标(SUN、CREA,p0.01)显著改善,肾脏发白、变硬情况显著改善,肾小管上皮细胞坏死、间质血管扩张充血等现象改善减轻;其他各给药组无治疗作用,其中TR组和TA组反而加重了重铬酸钾的损伤,表现为CREA更高、’肾脏病理损伤加重,且出现腹水。针对六价铬的羟自由基氧化损伤机制,大黄鞣质(TT)在体外对羟自由基的的半数清除率达70%,并能将六价铬还原为无毒的三价铬,TA和RC清除羟自由基和还原作用不明显。 (2)大黄不同部位对肾小管S1、S2段损伤的急性肾衰模型的作用：采用与前述正常动物毒性试验相同的给药剂量,分别灌胃给予大黄总提物和各成分部位共7天,实验第4天开始皮下注射氯化镉(3mg/kg)持续4天复制肾小管S1、S2段损伤的急性肾功能衰竭大鼠模型,至实验终点,各组均未发现死亡现象。与模型组比较,大鼠的异常升高,给予TR、TA和TT均可降低镉诱升的SUN、CREA值,尤其对CREA的降低作用明显,并且表现出对肾脏系膜细胞增生的改善。综合来看,TR保护作用最好,TA与TT的保护作用相当而弱于TR, RC的保护作用较差。大黄各部位均未见增强镉肾毒性的作用。 (3)大黄不同部位对肾小管S3段损伤的急性肾衰模型的作用：采用与前述正常动物毒性试验相同的给药剂量,分别灌胃给予大黄总提物和各成分部位共7天,实验第4天皮下注射氯化汞(2mg/Kg)复制肾小管S3段损伤的急性肾功能衰竭大鼠模型,至实验终点,模型组死亡6/8只,TR和TA组大鼠均死亡1/8只,TT组死亡4/8只,RC组死亡5/8只。与模型组比较,TR和TA可显著降低汞致SUN、CREA值的异常升高(p0.01)、TP和ALB的异常降低(p0.05),并显著改善肾小管上皮细胞的广泛坏死,表现为明显的治疗作用;TT对汞致肾中毒无明显保护作用,且大鼠腹腔有腹水现象;RC也无保护作用。 (4)大黄不同部位对肾小管上皮细胞损伤的急性肾衰模型的作用：采用与前述正常动物毒性试验相同的给药剂量,分别灌胃给予大黄总提物和各成分部位共7天,实验第4天开始皮下注射庆大霉素(200mg/Kg)持续4天复制复制肾小管上皮细胞损伤的急性肾功能衰竭大鼠模型,至实验终点,仅有TR组死亡2/8只动物,其余各组没有死亡现象。与模型组对比,TA、TT和RC对庆大霉素引起的SUN和CREA值的升高均没有明显的降低作用;而TR组反而使上述指标显著升高(p0.01),且使肾小管系膜细胞的增生比模型组显著加重。 4.综合分析： (1)大黄肾损伤与肾保护双向作用的客观真实性 (2)大黄肾损伤与肾保护作用的物质基础探讨 (3)有故无殒思想对中药毒性合理评价的探讨 综上,本文通过病证毒理学的大黄安全性评价模式和方法,科学地评价了大黄肾毒性和肾保护双向作用的客观真实性,实验证实了中医有故无殒思想对中药安全性评价的重要指导价值,为诠释中医辨证(病)用药减毒的科学性和可行性提供了重要依据,也为继承和发扬中医药传统毒性理论提供了新的研究思路和参考实例。
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