红缘拟层孔菌多糖分离纯化、结构表征及其免疫活性分析

作     者：彭慧群 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：戴军

授予年度：2016年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083202[工学-粮食、油脂及植物蛋白工程] 

主      题：红缘拟层孔菌 多糖 分离纯化 结构表征 免疫活性 

摘      要：红缘拟层孔菌(Fomitopsis pinicola(SW.)***)是一种药用蘑菇,具有抗菌,抗炎,抗肿瘤,降血糖等功效,是一种有较高开发价值的功能性食品资源。本文从红缘拟层孔菌子实体中提取了两种粗多糖,分别是水提粗多糖(FPS)和碱提粗多糖(FPJ),采用DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sepharose CL-6B柱层析对FPS分离纯化,得到四个多糖级分分别命名为FPS1-1、FPS1-2、FPS2-1、FPS2-2,并对这四个多糖级分进行了理化性质分析、结构表征及其免疫活性的研究,为后续构效关系的研究和开发利用提供了依据。以红缘拟层孔菌子实体为实验材料,通过水提醇沉法提取得到水提粗多糖(FPS),通过碱提醇沉法从水提之后残渣中提取得到碱提粗多糖(FPJ)。体外促进正常小鼠脾淋巴细胞增殖活性的结果显示:FPS、FPJ在浓度为20μg/m L、80μg/m L和320μg/mL时均有促脾淋巴细胞增殖活性,其中FPS具有一定的量效关系,FPS的促脾淋巴细胞增殖活性高于FPJ的促脾淋巴细胞增殖活性。并在后续实验中对FPS进行分离分级。通过DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sepharose CL-6B柱层析依次对红缘拟层孔菌水提粗多糖(FPS)进行分离分级,得到4个多糖级分,分别命名为FPS1-1、FPS1-2和FPS2-1、FPS2-2,苯酚硫酸法测得4个多糖级分多糖含量依次为93.34%、92.12%、89.18%、85.33%,紫外扫描结果显示四个多糖级分均含有少量蛋白质。采用高效体积排阻色谱-示差折光检测(HPSEC-RI)和体积排阻色谱光散射仪联用(SEC-LLS)分别分析各多糖级分分子量分布及其高级构象。根据HPSEC-RI的检测结果可知:四个多糖级分的分子量分布是均一的,其相对分子质量(Mw)依次为2.77×105,9.12×103,3.02×105,4.72×103;SEC-LLS测得四个多糖级分的高级构象可能为高度紧缩且具有分支结构。通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)、红外光谱(IR)和核磁共振(NMR)的1H谱和13C谱测得各多糖级分的单糖组成和糖苷键类型。单糖组成实验结果表明FPS1-1为葡聚糖;FPS1-2为含有甘露糖(Man),葡萄糖(Glc),半乳糖(Gal),木糖(Xyl),岩藻糖(Fuc)的杂多糖;FPS2-1为含有甘露糖(Man),葡萄糖(Glc),半乳糖(Gal),岩藻糖(Fuc)的杂多糖;FPS2-2为含有甘露糖(Man),葡萄糖(Glc),半乳糖(Gal)的杂多糖。四个多糖级分的FT-IR和NMR结果表明:FPS1-1可能是以α-(1→4)Glc为主链的葡聚糖;FPS1-2可能有α-(1→6)和β-(1→4)糖苷键两种链接方式;FPS2-1可能有α-(1→4)糖苷键链接方式;FPS2-2可能有α-(1→6)和β-(1→4)糖苷键两种链接方式。体外促进正常小鼠脾淋巴细胞增殖活性的结果显示:四个多糖级分在一定浓度下均有促脾淋巴细胞增殖活性,且FPS1-2及FPS2-1具有一定量效关系,其中FPS2-1的促脾淋巴细胞增殖活性最强;FPS2-1、FPS2-2在浓度为20μg/m L、80μg/m L和320μg/m L及FPS1-2在浓度为80μg/m L和320μg/m L时具有显著协同ConA促脾淋巴细胞增殖活性,FPS2-1及FPS2-2浓度的升高对其影响不大,无明显的量效关系,FPS1-2具有一定的量效关系,FPS1-1无明显协同ConA促进脾淋巴细胞增殖活性。体外促进正常小鼠巨噬细胞增殖活性的结果显示:四种多糖级分在一定浓度下对巨噬细胞均有增殖效果,其中FPS1-2促进巨噬细胞增殖效果最佳。多糖级分协同LPS促进巨噬细胞增殖活性高于多糖级分单独作用时,也高于LPS单独作用时,说明多糖级分能够促进LPS激活巨噬细胞增殖。