辣根素（AITC）对玉米象成虫酶的影响及与COX1结合位点预测

作     者：赵源 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张兴

授予年度：2016年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083203[工学-农产品加工及贮藏工程] 

主      题：玉米象 辣根素(AITC) 蛋白酶 细胞色素C氧化酶亚基I 结合位点 

摘      要：玉米象是重要的仓储害虫,为害范围广,程度重,是世界仓储头号害虫。现有多种化学熏蒸剂,因抗药性或毒性均存在使用的局限,辣根素(AITC)因其杀虫效果良好,残留量小,对环境和人体危害极小,被认为是具有广阔开发前景的植物源熏蒸剂物质。但目前关于AITC对玉米象的熏蒸机理尚不明确。本研究从玉米象成虫酶学、蛋白质组学、基因水平以及分子模拟对接探讨了AITC的杀虫熏蒸作用机制和可能的作用靶标,结果如下:1、AITC对玉米象体内过氧化氢酶、羧酸酯酶、线粒体呼吸链复合物II、细胞色素c氧化酶活力影响具有明显的剂量效应和时间效应。低剂量的辣根素可诱导过氧化氢酶、羧酸酯酶、线粒体呼吸链复合物II、细胞色素c氧化酶的增加,而高剂量的辣根素则对过氧化氢酶、线粒体呼吸链复合物II、细胞色素c氧化酶活力具有抑制作用;随着处理时间的增加,试虫体内的这两种酶活性逐渐下降。2、AITC处理玉米象成虫后,玉米象成虫的蛋白质含量发生了变化,与空白对照相比,1μl/L和2μl/L的AITC熏蒸处理玉米象成虫蛋白质含量有所增加;随着玉米象成虫死亡率的增加,玉米象成虫体内蛋白含量逐渐降低。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化行蛋白,并对差异蛋白进行HPLC-MS和MALDI-TOF/TOF,经数据库检索,影响的差异蛋白可能为细胞色素c氧化酶亚基I,(线粒体)[赤拟谷盗]相似度65%,MW 54815.1,cytochrome c oxidase subunit I,(mitochondrion)[Tribolium castaneum]。3、利用RACE方法得到COX1基因全长cDNA序列。COX1基因全长1500bp,编码499个氨基酸。与鳞翅目象甲科其他已在NCBI登记全长的COX1基因进行Blast同源性比对,发现COX1特有的4个双核中心(血红素a3/CuB)离子结合位点和5个低自旋血红素化学结合位点完全重合。具有COX1蛋白家族的典型特征,证实该开放阅读框编码玉米象COX1,命名为SzeaCOX1。4、使用同源建模的手段,分别以牛心细胞色素c氧化酶三维晶体结构(PDB:1V54)得到了玉米象COX1的三维结构,利用Procheck评价后与AITC进行分子对接。AITC的丙烯基部分位于COX1中由氨基酸残基Ile-59、Ile-375、Ile-376、Phe-379、Phe-454和Phe-6所组成的疏水性腔袋,形成强烈的疏水性相互作用。更重要的是,异硫氰酸丙烯酯另一端的硫原子可以与氨基酸残基Gly-13形长为3.2?的氢键相互作用。