黄曲霉毒素及其前体杂色曲霉毒素高灵敏高特异性单克隆抗体研制

作     者：李敏 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：李培武;张文

授予年度：2014年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：黄曲霉毒素B1 黄曲霉毒素M1 杂色曲霉毒素 高灵敏度 高特异性 单克隆抗体 酶联免疫吸附测定(ELISA) 

摘      要：随着经济的快速发展，生活质量的不断改善，真菌毒素污染等对农产品及食品安全产生的影响已成为近几年以来政府重视、社会关注、世界瞩目的热点问题。其中黄曲霉毒素是威胁农产品及食品安全的毒性最强的一类真菌毒素，黄曲霉毒素及其生物合成前体物杂色曲霉毒素的污染，不仅严重威胁人民的身体健康和生命安全，而且对我国的经济贸易有巨大的负面影响。因此，研究建立准确、灵敏、便捷的黄曲霉毒素和杂色曲霉毒素免疫分析技术势在必行。 抗体是免疫分析的关键核心试剂，靶标免疫分析灵敏度直接取决于其特异性抗体的特性。本课题组前期研制出了居国际领先水平的系列黄曲霉毒素单克隆抗体，其中黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素M1单克隆抗体与国内外抗体同比特异性最高。然而，黄曲霉毒素B1迄今特异性最强的单克隆抗体3G1仍与黄曲霉毒素B2有6.4%的交叉反应，且灵敏度有待大幅度提高;黄曲霉毒素M1迄今特异性最强的单克隆抗体2C9灵敏度仍有待提高。杂色曲霉毒素作为黄曲霉毒素的合成前体物，制备抗杂色曲霉毒素的单克隆抗体，可将其作为一种黄曲霉毒素前体物通用抗体探明黄曲霉毒素发生积累标志分子，从而为风险评估和污染防控提供理论依据，然而，国内外杂色曲霉毒素抗体研制方面鲜有报道。因此，研制同时具备高灵敏度和高特异性的黄曲霉毒素及其前体杂色曲霉毒素单克隆抗体，研发基于该抗体的免疫快速检测技术和产品，对于农产品质量安全风险评估及预警，保障人民的农产品、食品消费安全，促进农业产业的可持续发展，打破贸易技术瓶颈均具有重要的意义。 针对上述黄曲霉毒素及其前体杂色曲霉毒素高灵敏高特异性抗体缺乏的关键性技术难题，本论文的主要研究内容和创新点如下： 1.选育出黄曲霉毒素B1抗体杂交瘤细胞株1B5等，研制出高灵敏高特异性黄曲霉毒素B1单克隆抗体，灵敏度提高了100倍以上。制备高质量抗体的关键是制备高质量的人工抗原，人工抗原制备最关键的是半抗原结构的设计，本研究参考Christian Cervin所述方法，并在此基础上进行改进，合成了一种新的黄曲霉毒素完全抗原AFB2-GA-BSA;同时，按照经典肟化方法合成了AFB1-BSA。AFB2-GA-BSA按传统免疫剂量（50μg/次）免疫小鼠，AFB1-BSA按照加大剂量(150μg/次)免疫小鼠，均通过细胞融合、半固体培养基培养、两步梯度法筛选，最终，利用加大剂量的AFB1-BSA免疫小鼠，选育出了4株性能良好的单克隆细胞株，分别是1F11、2F12、2C7、1B5。采用间接竞争ELISA测定系列抗体的灵敏度，并计算交叉反应率，抗体针对黄曲霉毒素B1反应灵敏度高，与B2，G1，G2的几乎不存在交叉反应。并且以灵敏度和特异性为综合分析点，与国内外同类抗体对比后可以发现，1B5是迄今最好的针对黄曲霉毒素B1的单克隆抗体。以单克隆抗体1B5为基础，研究建立了AFB1间接竞争酶联免疫吸附分析技术（Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA）。其中包被抗原AFB2-GA-BSA的浓度为0.0625μg/mL，1B5单克隆抗体稀释度为1:20000。并对封闭试剂、pH值、盐离子浓度等理化参数进行了优化。 2.选育出黄曲霉毒素M1抗体杂交瘤细胞株LM13等，研制出高灵敏高特异性黄曲霉毒素M1单克隆抗体，灵敏度均提高了2倍以上。为获得更高灵敏度，高特异性AFM1抗体，在前期基础上，加大了免疫剂量，延长了免疫周期。通过细胞融合技术，半固体培养基基，两步梯度法筛选最终获得9株抗AFM1单克隆细胞株，分别命名为LM47、LM15、LM16、LM54、LM13、LM32、LM44、LM48、LM46，采用间接竞争ELISA对上述纯化抗体进行灵敏度检测，并计算交叉反应率，结果显示，所得抗体灵敏度均比2C9抗体提高2倍以上，大部分抗体与AFB1，AFB2，AFG1，AFG2交叉反应较低。以灵敏度最高的单克隆抗体LM13为基础，研究建立了AFM1间接竞争ELISA方法。其中包被抗原AFM1-BSA的浓度为0.0625μg/mL，LM13单克隆抗体稀释度为1:120000。并对封闭试剂、pH值、盐离子浓度等理化参数进行了优化。 3.选育出能稳定分泌抗杂色曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株ST3等，研制出高灵敏高特异性杂色曲霉毒素单克隆抗体。本研究通过打开ST分子结构中双呋喃环的双键与蛋白实现偶联，并将ST人工抗原进行紫外扫描，结果表明其特征吸收峰与BSA和ST的特征吸收峰有明显差异，BSA与ST成功偶联。利用新合成的ST完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合、半固体培养基培养、两步梯度法筛选，最终筛选得到3株性能良好的单克隆细胞株，分别是ST3，ST4，ST6。采用间接竞争ELISA测定系列抗体的灵敏度，并计算交叉反应率，灵敏度均很高，且不与AFB