Figla在小鼠胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化中的作用

作     者：胡玥 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：华进联

授予年度：2012年

学科分类：0907[农学-林学] 090705[农学-野生动植物保护与利用] 09[农学] 

主      题：胚胎干细胞 雌性生殖细胞 Figla 小鼠 

摘      要：干细胞和生殖细胞的发生、增殖、分化是生命科学研究的重要课题之一。本世纪以来，不孕不育症患者的比例显著增加，而目前对因卵母细胞的发生、成熟障碍引起不孕的患者还缺乏有效的治疗手段。同时，卵母细胞也是发育生物学中一个重要的研究对象。然而，高等哺乳动物卵母细胞的发生、转移、分化完全在体内完成，因此很难动态实时地检测和研究其中的分子事件。近年来，已有研究报道干细胞可分化为生殖系细胞，甚至可能进一步分化为卵母细胞或精子。但目前干细胞向生殖细胞尤其向卵母细胞分化的效率较低，且重复性较差。Figla（生殖系a因子）是最早表达的生殖细胞特异性转录因子之一，对卵泡的发育、Zp基因的表达和透明带的形成具有调节作用。本研究PCR克隆了Figla的动子，构建了pFigla-EGFP-1载体，转染小鼠胚胎干细胞（mESCs）筛选得到了携带pFigla-EGFP-1载体的ES细胞株，首次建立了mESCs向生殖细胞分化的监测和筛选系统;评估了维甲酸（RA）、卵泡液（PFF）、促卵泡激素（FSH）、与卵巢细胞共培养、体内移植和基因超表达对诱导mESCs向雌性生殖细胞分化的作用;研究了Figla基因对生殖特异性基因表达的调控作用。 1. pFigla-EGFP-1转染小鼠胚胎干细胞株的筛选纯化 通过生物信息学方法分析预测出Figla基因的启动子区，构建了pFigla-EGFP真核报告载体，将其导入mESCs，筛选出稳定携带pFigla-EGFP载体的小鼠ES细胞株。经检测，此株细胞维持胚胎干细胞的典型生物学特性：能稳定增殖，同时表达多能性标记，且具有体内、外的三胚层分化潜能。 2.不同方法诱导mESCs向雌性生殖细胞分化 通过悬浮法使mESCs形成类胚体(EBs)，向培养液中添加RA、卵泡液和FSH，或将EBs与卵巢细胞共培养，或将mESCs与卵巢细胞包埋后进行体内移植，诱导mESCs向卵母细胞分化。通过形态学结合RT-PCR、免疫荧光染色、流式细胞分选及雌二醇激素测定等，对分化得到的类生殖细胞进行检测。结果显示，部分EBs首先分化出原始生殖细胞，随后EBs分化形成卵巢样结构，在RA、卵泡液、FSH或与卵巢细胞共培养的条件下，可分化出表达生殖特异性基因的类卵母细胞。mESCs与卵巢细胞包埋入肾被膜后，在体内可以向生殖细胞分化，形成卵泡样结构。转染pFigla-EGFP载体的ES细胞株向生殖细胞分化后，绿色荧光蛋白（GFP）表达，同时表达生殖特异基因Vasa、Stra8、Scp3和Zp3，表明该细胞株可以作为ESCs向生殖细胞分化的监测和筛选系统。 3. Figla超表达对mESCs向雌性生殖细胞分化的作用 通过PCR技术从小鼠卵巢cDNA中扩增了Figla基因，构建出真核表达载体pDsRed1-N1-Figla。用该载体转染mESCs，红色荧光蛋白(RFP)表达，生殖及卵母细胞标志基因的表达上调。表明超表达Figla基因可以促进mESCs向生殖细胞分化，且Figla对生殖特异性基因具有调控作用，可激活雌性生殖细胞基因表达。