猪圆环病毒2型和细小病毒共感染对猪肺泡巨噬细胞免疫功能的影响

作     者：刘祥义 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋勤叶

授予年度：2010年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪圆环病毒2型 细小病毒 共感染 肺泡巨噬细胞 免疫功能 

摘      要：猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合症等猪圆环病毒病(PCVD)的病原,而猪细小病毒(PPV)是PCVD发病的重要协同致病因子。已知猪肺泡巨噬细胞(PAM)既是PCV2与PPV的主要靶细胞,又是重要的免疫细胞。本研究通过分析PCV2与PPV共感染健康仔猪的PAM吞噬功能、细胞因子和重要抗原递呈相关分子表达水平动态变化,从细胞与分子水平探讨PCV2与PPV共感染对猪PAM免疫功能的影响。 应用RT-PCR技术,从猪PAM中分别扩增并克隆了猪抗原递呈功能相关分子CD80、CD86和细胞因子IL-1β、IFN-α1、TNF-α等及管家基因β-actin的部分基因片段,构建了相应分子的阳性重组质粒,建立了检测上述各种分子的实时荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)的标准曲线及其直线回归方程,确定了其最适反应条件。 将48头35日龄的健康仔猪分为PCV2单独感染组、PPV单独感染组、PCV2/PPV共感染组和空白对照组4组,12头/组。分别于感染后第3、7、14、35 d随机剖杀3头,收集PAM。通过台盼蓝染色和鸡红细胞吞噬试验,分别检测了感染后不同时间PAM的存活率和吞噬功能的动态变化。结果表明,感染后整体上PCV2/PPV共感染组PAM的存活率与PCV2单独感染组的差异不显著,但共感染组PAM的吞噬活性显著低于PCV2和PPV单独感染组。 应用Real-time FQ-PCR测定了感染后不同时相PAM表达的促炎细胞因子、趋化细胞因子和调节细胞因子mRNA水平。结果显示,PCV2/PPV共感染导致促炎细胞因子TNF-α和IL-1βmRNA转录水平在感染早期显著上升(P0.01),IFN-α1的表达水平出现持续抑制,但IL-6的水平上调;导致趋化因子IL-8表达量持续降低,MCP-1与MIP-1β含量在感染早期显著升高,后期显著降低(P0.05);引起调节细胞因子IL-10表达水平早期突然升高(P0.01),IL-12p40的表达水平在14DPI时显著上升,而IFN-γ、IL-18与GM-CSF的表达持续受到抑制。综合分析上述细胞因子的表达动态表明,PCV2/PPV共感染可以加重局部的急性炎症反应,导致机体早期抗病毒能力和趋化功能降低,使机体的免疫调节机能出现抑制和紊乱。 应用流式细胞术和Real-time FQ-PCR,分别检测了感染后不同时相PAM表达SLA-1类分子、SLA-DR分子及CD80、CD86 mRNA的含量,结果显示:PCV2/PPV共感染组在35 DPI时SLA-1含量显著下调(P0.01),7 DPI时SLA-DR含量低于PCV2单独感染组的表达水平(P0.05)。CD80和CD86 mRNA的转录水平在35 DPI时均显著低于PCV2感染组。此结果表明,PCV2/PPV共感染初期引起外源性抗原递呈功能的严重抑制,感染后期主要引起内源性抗原递呈功能的显著降低。 综合上述研究结果表明,PCV2/PPV共感染对PAM的存活率影响不明显,但是能够显著降低PAM的吞噬能力,加重局部的急性炎症反应,导致机体早期抗病毒能力和趋化功能降低,使机体的免疫调节机能和抗原递呈功能出现抑制,PPV在PCV2对PAM的免疫致病过程中起到了重要的协同作用。