氢气对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

作     者：薛江波 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：付春景

授予年度：2009年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：心肌细胞 凋亡 缺氧/复氧损伤 氢气 线粒体膜电位 脂质过氧化 

摘      要：背景 心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injuy,MIRI)是临床上常见的病理生理现象,可见于冠状动脉再通术(溶栓、冠状动脉成形术或搭桥术等),心脏直视手术应用心肌停搏液时。缺血再灌注损伤危害巨大且难以避免如短时间的冠脉梗阻并不引起心肌细胞的不可逆性严重损伤,但冠脉再通后却发生了不可逆性结构和功能的损伤,并加速己有损伤细胞的死亡。因此,如何保护缺血心肌细胞,防治心肌缺血/再灌注损伤已经成为现代心脏病学的研究热点之一。近年来的研究表明,自由基诱导心肌细胞凋亡可能是其引发心肌缺血再灌注损伤的机制之一。 2007年7月Nature Medicine报道Ohsawa等人研究发现大鼠通过吸入氢气选择性清除氧化性极强的羟自由基(·OH),抗氧化抑制细胞凋亡,显著减轻脑缺血再灌注损伤。最近Hayashida等人发现氢气可以显著减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。但是氢气对离体的心肌细胞的缺血再灌注损伤是否有保护作用目前尚未见报道。 目的 从细胞水平探讨氢气对体外培养的心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响,并对其作用机制进行初步研究。观察离体心肌缺氧复氧损伤后细胞存活率,线粒体膜电位,脂质过氧化和细胞凋亡率的变化,从细胞凋亡的角度探讨氢气抗心肌缺血再灌注损伤的可能机制。 方法 体外原代培养乳鼠的心肌细胞,经缺氧60min复氧30min,建立心肌细胞缺氧复氧损伤模型。用缺氧溶液置换正常培养液造成缺氧,用复氧溶液置换缺氧溶液模拟再灌注损伤。实验分四组:①对照组;②缺氧/复氧损伤(H/R)模型组;③低浓度氢气组:2%氢气预处理心肌细胞后再缺氧/复氧;④高浓度氢气组:4%氢气预处理心肌细胞后再缺氧/复氧。分别检测以下指标:①倒置显微镜观察心肌细胞形态学变化并拍照;②免疫细胞化学方法鉴定细胞纯度;③MTT法检测心肌细胞活力;④TUNEL法检测心肌细胞凋亡;⑤罗丹明123(Rhodamine123,Rh123)染色,荧光显微镜下观察Rh123荧光强度,以了解细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△ψm)的变化情况;⑥测定心肌细胞丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。 统计方法:文中所有实验数据均以均数士标准差((?)±S)表示,两组以上比较应用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析,两组间比较采用t检验。P0.05表示组间有显著性差异。 结果 1.心肌细胞形态学改变倒置显微镜下观察,正常心肌细胞培养72h后,细胞成簇生长并伸出伪足,折光性强,且搏动明显。细胞形态呈现多样化,如圆形、梭形及椎形。缺氧/复氧损伤后心肌细胞伪足缩短或消失,折光性下降,搏动减弱或消失。氢气组心肌细胞形态均得到明显改善。 2.免疫细胞化学鉴定心肌细胞纯度为95%,培养得到高纯度的心肌细胞。 ***细胞活力检测与H/R组比较,氢气预处理组细胞存活率明显升高(P0.05),且高浓度氢气组细胞存活率较低浓度氢气组高(P0.05),表明氢气能够增强缺氧/复氧后心肌细胞活力,且较高浓度效果更好。 ***法检测细胞凋亡与H/R组比较,氢气预处理组细胞凋亡率明显降低(P0.05),且高浓度氢气组细胞凋亡率较低浓度氢气组低(P0.05),表明氢气能够抑制缺氧/复氧后心肌细胞凋亡,且较高浓度抑制作用更好。 ***123染色后荧光显微镜观察H/R组心肌细胞的Rh123荧光强度较对照组明显减弱,表明缺氧/复氧损伤可降低细胞的线粒体跨膜电位,而用氢气预处理后,细胞的Rh123荧光强度较H/R组明显增强,表明氢气对缺氧/复氧导致的心肌细胞线粒体膜电位下降具有抑制作用。 6.心肌细胞MDA含量与H/R组比较,氢气预处理组细胞MDA含量明显降低(P0.05),且高浓度氢气组细胞MDA含量较低浓度氢气组低(P0.05),表明氢气能够抑制心肌细胞脂质过氧化反应,且较高浓度抑制效果更好。 结论 1.氢气对大鼠乳鼠的心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用,该作用的机制可能是氢气通过清除缺氧/复氧是产生的自由基保护线粒体膜,抑制线粒体膜电位下降,减轻脂质过氧化反应,从而抑制细胞凋亡,增强细胞活力。 2.较高浓度的氢气对心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用更强。