根癌农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化及植株再生研究

作     者：姜泽海 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李哲

授予年度：2011年

学科分类：0907[农学-林学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学] 

主      题：橡胶树 根癌农杆菌 胚性细胞悬浮系 遗传转化 植株再生 

摘      要：橡胶树胚性悬浮系及其植株再生体系的建立为橡胶树遗传转化的研究提供了良好的材料。本研究以橡胶树品种热研8-79胚性悬浮细胞为受体,研究了菌液浓度、共培养基pH值及添加乙酰丁香酮浓度、共培养温度、共培养时间及共培养方式对农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化的影响,优化了转化条件。通过卡那霉素浓度梯度筛选获得了抗性愈伤组织系,并分化得到拟转化胚状体及再生植株。GUS组织化学染色、PCR检测、测序分析及Southern杂交结果表明,外源基因已经成功整合进入橡胶树基因组DNA中。为有目的地改良橡胶树性状、改良和开发橡胶树种质资源、提供有力工具,也为基因功能研究提供良好条件。主要结果如下： 1.农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化的影响因素研究：以GUS基因(uidA)瞬时表达频率和悬浮细胞存活率为指标,采用单因子实验设计对农杆菌菌液浓度、共培养基pH值、共培养基添加AS浓度、共培养温度、共培养时间及共培养方式6个因素进行研究,确定农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化的适宜条件为：农杆菌菌液CD600值为0.3-0.5;共培养基pH值5.2;农杆菌重悬浮和共培养培养基中添加100-150μM的乙酰丁香酮;共培养温度20-22℃;共培养时间4-5 d;采用固体共培养方式共培养。 2.抗性愈伤组织、胚状体及再生植株的获得：在农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞的遗传转化中,农杆菌抑菌选用300 mg/L的替卡西林;以卡那霉素作为选择抗生素,采用从低到高浓度梯度(50、75、100 mg/L)筛选的方式进行。在该方式下,总共获得10个抗性愈伤组织系,2177个拟转化胚状体,165株拟转化再生植株。3.分子检测：经GUS组织化学染色、PCR检测、测序分析和Southern杂交分析,确定外源基因npt-Ⅱ基因已经成功整合进入橡胶树基因组DNA中。 4.本研究采用农杆菌介导法成功地对橡胶树胚性悬浮细胞进行了遗传转化,初步建立起了农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化体系。