MUC4在肺腺癌转移及其上皮间质转变中的功能研究

作     者：高留伟 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王长利

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：MUC4 肺腺癌 上皮间质转化 侵袭转移 β-catenin 

摘      要：目的 肺癌是全球癌症死亡的主要原因,腺癌是肺癌中最常见的一种类型。MUC4粘附蛋白是一种高分子量跨膜糖蛋白,与多种肿瘤的发生相关联,并且MUC4的过量异常表达常在癌症的侵袭和转移过程中被观察到。上皮间质转变,是具有极性的上皮细胞转换为具有运动能力的间充质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程,它存在于动物多个生理和病理过程中,并涉及复杂的信号通路调节过程,行使多种生理功能。这个过程最初发现于早期胚胎发育进展中,并且与组织的纤维化也相关联,之后,上皮间质转变也与恶性肿瘤的侵袭和转移有关。本研究旨在观察MUC4在肺腺癌侵袭转移中的功能作用,同时进一步研究其对上皮间质化的调控机制,为肺腺癌临床诊断及治疗提供新的靶点。 方法 常规培养肺腺癌细胞株,通过Western Blotting试验,检测MUC4粘蛋白在肺腺癌细胞株中的高低表达。构建MUC4-siRNA表达载体,经脂质体2000转染肺腺癌细胞株,分为实验组(转染载体MUC4-siRNA)及对照组(空载体Control-siRNA),Western Blotting试验检测MUC4、E-cadherin、Vimentin的表达变化,倒置显微镜观察两组细胞形态的变化,细胞迁移实验观察MUC4高低表达对细胞运动能力的影响,细胞免疫荧光实验检测MUC4高低表达对P-catenin的影响,并且通过Western Blotting试验检测β-catenin在细胞膜、细胞质、细胞核的表达变化。动物实验分为MUC4-knockdoown-LTEP种植鼠(129/sv)及MUC4-control-LTEP种植鼠(129/sv)两组,免疫组化及Western Blotting试验检测两组鼠肺组织中的MUC4、E-cadherin、Vimentin的变化。通过PET-CT从天津市肿瘤医院筛选出各15例Ⅰ期及Ⅲ期病人,并取其肺癌组织标本,病理证实Ⅰ期及Ⅲ期肺腺癌标本各10例,Western Blotting试验检测20例肺癌组织标本中MUC4粘蛋白的表达变化,通过统计分析20例肺癌组织标本中MUC4粘蛋白高低表达与肺癌淋巴结转移相关性。 结果 1.体外细胞实验,MUC4粘蛋白在肺腺癌细胞株LTEP、SPCA中高表达,然而在肺腺癌细胞株GLC-82、A549中低表达。MUC4-siRNA经脂质体2000转染LTEP细胞,LTEP细胞发生上皮间质转变,与对照组相比较,MUC4粘蛋白和上皮标记物E-cadherin表达减少,间质标记物Vimentin表达增加;LTEP细胞(转染MUC4-siRNA)形态分别从卵圆形转变为纺锤形,细胞极及细胞接触排列无序。 2.细胞迁移实验：与对照组相比,LTEP细胞(转染MUC4-siRNA)穿孔细胞数量明显增多(P0.01)。3.细胞免疫荧光及Western Blotting定量实验：与对照组相比,实验组LTEP细胞中β-catenin向细胞质集聚及细胞核转移,与细胞膜结合的β-catenin明显减少。 4.原位动物实验模型：与MUC4-control-LTEP种植鼠相比,MUC4-knockdown-LTEP种植鼠,肿瘤肺组织中MUC4粘蛋白和上皮标记物E-cadherin表达明显减少,间质标记物Vimentin表达明显增加。 5.人肺腺癌标本Western Blotting定量实验：10例无淋巴结转移的肺腺癌标本中6例MUC4低表达,然而,10例伴随淋巴结转移的肺腺癌标本中MUC4全部低表达。统计分析20例肺腺癌标本中MUC4表达与淋巴结转移相关性,数据显示MUC4低表达与肺腺癌淋巴结转移相关(P0.01)。 结论 ***4粘蛋白低表达可诱导LTEP细胞发生上皮间质转化 2.随着MUC4粘蛋白低表达,LTEP细胞穿孔细胞数量明显增多(P0.01),表明MUC4粘蛋白与肺腺癌细胞侵袭迁移能力有关。 3.随着MUC4粘蛋白低表达,LTEP细胞中β-catenin分别向细胞核转移及细胞质集聚,与细胞膜结合的β-catenin明显减少,表明MUC4粘蛋白通过调控β-catenin胞核转位抑制肺腺癌细胞上皮间质转化的发生 4.通过原位动物实验模型,MUC4-knockdown-LTEP种植鼠肺组织中MUC4粘蛋白的减少伴随着上皮标记物E-cadherin表达减少,间质标记物Vimentin表达增加,表明在体内试验中MUC4粘蛋白表达与上皮间质转化的发生相关。 5.在没有淋巴结转移的10例Ⅰ期肺腺癌标本中6例MUC4低表达,然而,在有淋巴结转移的10例Ⅲ期肺腺癌标本中MUC4全部低表达,并且通过数据统计分析MUC4低表达与肺腺癌淋巴结转移相关性(P0.01),表明MUC4与肺腺癌患者的侵袭转移紧密相关,因此对MUC4的评估可能作为判断肺腺癌预后的分子标志物,并为肺腺癌个体化治疗