一株马立克氏病病毒野毒株的分离鉴定及其对海兰褐蛋鸡的致病性分析

作     者：祖铭 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：崔治中

授予年度：2017年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：马立克氏病 禽白血病 野毒株 序列分析 核苷酸类逆转录酶抑制剂 致病性 

摘      要：禽马立克氏病(Marek’sdisease,MD)能够引起禽类的恶性淋巴肿瘤性疾病,主要在皮肤、内脏器官等位置引起肿瘤病变,是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)引起的具有高度传染性的传染病。MDV可分为3种血清型:血清1型,对鸡有致病性并能够导致鸡的肿瘤病变,如Md5(超强毒)和JW、京1(强毒)等;血清2型,对鸡不致病同时也不能导致肿瘤病变,如301B/1、SB/1等;血清3型,这是一株由火鸡上分离得到的疱疹病毒株(HVT-FC126株),对鸡并无致病性,但临床实验证明鸡接种此血清型能够产生较好的免疫力。J亚群禽白血病(Avian leukosis subgroup J,ALV-J)是在20世纪90年代初发现的由J亚群禽白血病病毒(Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)引起的可造成髓细胞样瘤细胞增生的一种肿瘤性疾病,自发现开始,随后在世界各地均有发现。根据追踪调查,近几年其宿主范围发生了明显变化,已经扩散到了地方品系鸡,进而引起地方品系鸡发生不同类型的肿瘤病变,临床上多表现为骨髓细胞瘤或血管瘤与骨髓细胞瘤混合发生的病例,进而说明ALV-J的病原特性以及致瘤性均发生了变化。本研究对南方某爆发肿瘤病的三黄鸡场送检的病料及血样,进行了几种引起肿瘤病的病毒的分离及鉴定,发现其存在马立克氏病与J亚群禽白血病的混合感染,并成功的分离到一株MDV的野毒株和ALV-J,然后对其主要的致病基因进行了克隆测序分析,同时利用反转录酶抑制剂类药物拉米夫定和齐多夫定对该MDV毒株进行了纯化,最后在海兰褐鸡进行了该MDV的致病性实验。具体研究结果如下:1.三黄鸡中MDV与ALV-J混合感染的诊断及病毒的分离和鉴定本研究根据送检病鸡的临床变化及剖检分析,初步判定为肿瘤病病毒感染,而后进行了病毒的分离鉴定。取抗凝血分离得到血浆接种到长至70%左右的鸡胚成纤维细胞(CEF)分离病毒,维持7天,传代后继续维持7天,同时,用ELISA方法检测细胞上清中p27抗原,发现p27阳性。同时每代观察有无蚀斑的出现,在第三代的第三天出现蚀斑。采用间接免疫荧光试验(IFA)分别鉴定MDV、ALV。其中,用MDV单克隆抗体H19、BA4均看到阳性细胞,结果表明分离到的为野毒株MDV;利用ALV-J的单克隆抗体JE9发现分离到的ALV为ALV-J,综合各个结果分析得知该三黄鸡鸡群中存在较为严重的ALV感染。通过病毒分离及IFA鉴定可以确定在该群三黄鸡体内存在MDV和ALV的混合感染,MDV命名为GX1701,ALV命名为GDSH1701。2.三黄鸡群中MDV野毒株的致病基因分子克隆序列分析同时扩增两种肿瘤病病毒的相关基因,其测序结果与IFA结果一致。对野毒株MDV GX1701的致病基因pp38、meq进行了 PCR扩增,分子克隆及连接转化,测序分析,对扩增的MDV的pp38、meq基因与标准参考毒株进行序列对比分析发现:本毒株与国内外参考毒株序列同源性分别为97.5%、95.3%。发现该野毒株meq基因第575-577位的碱基为CAC,且具有177bp的插入,这是强毒株的特征,本毒株与中国早期分离的GX0101亲缘关系较近,pp38基因相对比较保守,与GX0101序列完全一致。根据对MDV的致病基因的序列比对看出,该分离毒株为强毒,但对于其各自的致病性还需要进一步的致病性试验研究。3.利用核酸类逆转录酶抑制剂去除MDV野毒中的禽白血病病毒利用核苷类逆转录酶抑制剂类药物齐多夫定(AZT)和拉米夫定(LAM)消除MDV中ALV的污染。之前的研究已经证实,在培养液中添加不超过5mg/L的抑制剂类药物对于CEF细胞的复制和活性没有影响。体外试验证实,当在培养液中分别添加5mg/L的AZT可以显著抑制ALV在CEF细胞上的复制,利用此种方法,经药物连续干预10代后,ELISA检测p27抗原阴性,且以ALV-J单抗JE9进行IFA也没有发现阳性细胞。因此,我们得到了纯化的MDVGX1701。***野毒株的动物回归实验及其致病性分析为了进一步观察比较分离到的MDV野毒株的致病性及其能否突破CVI988疫苗的防护,将净化后的GX1701定量,1日龄时50只海兰褐雏鸡免疫1羽份CVI988疫苗,另外50只雏鸡不免疫作为对照,5日龄分别攻毒2000 PFU GX1701野毒株,进行了致病性试验以及免疫保护性实验。结果显示,GX1701毒株毒力较强,其中单独感染MDV病毒的鸡出现临床症状主要集中于8-9周,临床症状最早被发现于攻毒后25天,鸡只死亡最早出现于攻毒后的10天,发病鸡羽毛松乱,25天后死亡的病鸡并伴有劈叉症状,感染毒株GX1701并免疫CVI988疫苗的海兰褐鸡群最早出现死亡鸡在15天后,并在30天发现一只剖