CTRP9对低氧性肺动脉高压的保护作用及机制研究

作     者：金巧艳 

作者单位：第四军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙新;张海锋

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：低氧性肺动脉高压 肺血管内皮功能障碍 血管活性物质 CTRP9 

摘      要：【背景】肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)难治且预后差,可导致右心衰竭和死亡,是一种严重危害人类健康的疾病。低氧性肺动脉高压(hypoxia-induced pulmonary hypertension,HPH)是PH常见的临床类型,常见于高原、低氧环境或肺部疾病的病理状态下,由于其病生理机制复杂,尚未彻底阐明,因此,目前治疗PH的方法有限,只能达到临床缓解,不能改变患者最终需要肺移植的结局。研究发现低氧刺激引起肺血管内皮损伤,可导致肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)表达分泌的多种血管活性因子、生长因子、细胞因子、炎症因子发生异常,且PMVECs活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)生成及凋亡增加。C1q肿瘤坏死因子相关蛋白9(C1q/TNF-related protein 9,CTRP9)是一种新发现的内源性脂肪细胞因子,在脂代谢、心血管功能等的调控中发挥重要的作用。CTRP9能够促进主动脉血管内皮产生NO,引起血管舒张,具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抑制ADP诱导的血小板聚集、抑制内膜损伤后的血管重塑、抑制血管周围炎症和白细胞黏附等作用,对体循环动脉血管具有多重保护作用,然而,CTRP9对低氧引起的肺血管内皮功能失调有何影响,其分子机制为何,尚未见报道。因此,本研究旨在探讨CTRP9能否影响低氧引起的肺血管内皮损伤,并进一步研究其分子机制是否与影响血管活性因子及炎症因子等有关,期望为应用CTRP9缓解低氧性肺动脉高压提供实验证据,为防控低氧性肺动脉高压提供新策略和新靶点。【实验目的】(1)阐明CTRP9对低氧环境PMVECs功能的影响及其分子机制。(2)明确在整体水平肺组织过表达CTRP9能否改善肺血管内皮功能障碍,进而缓解HPH。【实验方法与结果】(1)分离培养健康雄性SD大鼠原代PMVECs,组织块贴壁72h后倒置显微镜下从形态学上鉴定PMVECs,可见组织块周围细胞融合生长成片状的细胞单层,多角形或类圆形细胞呈铺路石样分布、细胞透亮、轮廓清晰、连接紧密,证实PMVECs培养成功。(2)分离培养PMVECs,利用50ml/L O2、50ml/L CO2、900ml/L N2在细胞水平复制HPH模型。实验随机分为4组,分别为:常氧组(210ml/L O2、50ml/L CO2)、低氧组(50ml/L O2、50ml/L CO2、900ml/L N2)、低氧+CTRP9同时孵育组、低氧+CTRP9+Compound C孵育组(用Compound C在常氧预孵育30min后,给予CTRP9孵育的同时低氧处理),处理48h。收集细胞培养上清,分别用硝酸还原酶法、ELISA法测量NO和ET-1含量;收集细胞,抽提细胞总蛋白,用Western blot检测AMPK/p-AMPK、e NOS/p-e NOS、ERK1/2/p-ERK1/2变化。结果显示CTRP9抑制低氧时PMVECs中AMPK、e NOS磷酸化水平及NO生成的降低、ERK1/2磷酸化水平及ET-1生成的增加,该调节作用可被AMPK抑制剂Compound C抑制。(3)进一步研究CTRP9对PMVECs分泌的血管活性物质NO和ET-1的影响作用及机制,培养人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs),采用慢病毒载体在基因水平干扰AMPK(Lv-PRKAA1-RNAi)后,观察CTRP9的作用。结果显示,用Lv-PRKAA1-RNAi干扰后,CTRP9在低氧条件下促进p-AMPK、p-e NOS、NO产生、抑制p-ERK1/2、ET-1生成的作用降低。(4)原代培养的PMVECs分别在常氧(210ml/L O2、50ml/L CO2)、低氧(50ml/L O2、50ml/L CO2、900ml/L N2)、或者低氧+CTRP9(5μg/ml)环境中孵育48h。收集细胞培养上清,ELISA检测炎症因子IL-6、TNF-α,提取细胞总RNA,用RT-PCR检测IL-6、TNF-αm RNA变化。结果显示:与常氧组相比,低氧处理使两种炎症因子IL-6、TNF-α在PMVECs中m RNA水平及在细胞培养上清中的含量均增加;在低氧的同时给予CTRP9孵育时,与单纯低氧组相比,两种炎症因子在PMVECs中m RNA水平及在细胞培养上清中的含量均降低。(5)原代培养的PMVECs分别在常氧(210 ml/L O2、50 ml/L CO2)、低氧(50 ml/L O2、50 ml/L CO2、900 ml/L N2)、或者低氧+CTRP9(5μg/ml)环境中孵育48h。收集细