化脓性链球菌溶血素O基因功能初步研究

作     者：杨思源 

作者单位：西南交通大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李学如

授予年度：2016年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：化脓性链球菌 链球菌溶血素O SLO跨膜结构缺失突变 SLO活性结构缺失突变 致热外毒素B 

摘      要：化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)是一类严格以人作为宿主的链球菌,广泛存在于人的粪便和鼻咽部位,可引起从普通非侵袭性疾病如咽炎、猩红热、脓疱病到侵袭性和严重侵袭性疾病如风湿热等疾病的常见人类专性致病菌。链球菌溶血素O(Streptolysin O;SLO)是链球菌产生的重要毒素之一。它不仅可以引起溶血,同时也可强烈引起真核细胞膜损伤,影响细胞膜的物质转运过程,使靶细胞释放胞内成分并致溶解,SLO在链球菌感染过程中起着重要作用。生物信息分析化脓性链球菌溶血素O蛋白结构表明,SLO蛋白除含有由461氨基酸残基组成的溶血活性结构域Thiolytolysin外,在N端还有一跨膜结构域。本研究利用pET101-GENE蛋白表达系统,成功构建出高表达具有SLO活性的重组蛋白重组子,采用镍柱亲和层析分离技术,纯化目的蛋白;纯化蛋白SDS-PAGE检测分析表明,重组蛋白与预测的溶血活性结构域的分子量相一致;溶血实验显示,纯化重组蛋白具有溶血活性。以纯化的重组蛋白为免疫原,对大鼠进行4次免疫,所获得免疫血清经Elisa检测,抗SLO血清效价达到1：12800;Western Blot检测猪链球菌、马链球菌和化脓性链球菌中的链球菌溶血素结果显示,抗SLO多克隆抗体仅能与化脓性链球菌SLO发生反应,表明所研究制备化脓性链球菌SLO活性结构重组蛋白抗原具有的较好特异性。通过基因敲除的方法,构建化脓性链球菌SLO基因跨膜结构缺失株ATM和SLO基因活性结构缺失株AThiolytolysin,溶血活性分析验证,无论是跨膜结构缺失株还是溶血活性结构域缺失突变株,均丧失SLO溶血,进一步通过Western Blot分析发现,在两株突变株培养基上清中不能检测到SLO的杂交信号,因此推断,跨膜结构缺失可能影响了SLO的分泌。比较slo基因跨膜结构域缺失菌株,SLO溶血活性结构域缺失菌株与化脓性链球菌野生菌株NADase、GAPDH和SpeB等毒力因子活性,结果表明,三株菌NADase活性无明显差异。检测细胞表面的GAPDH活性发现,跨膜结构缺失株与Thiolytolysin缺失株的活性分别是野生株的17.3%和90.5%。对化脓性链球菌分泌蛋白进行SDS-PAGE电泳分析发现,跨膜结构缺失株SpeB的成熟明显推迟,而缺失失活株SpeB的成熟稍微提前。细胞粘附实验发现,跨膜结构缺失株与血活性结构域缺失株的相对粘附数是野生株的分别为58%和129%。同时,利用台盼蓝染色分析菌株上清液对宿主细胞通透性改变情况发现,两株突变株改变细胞通透性能力均降低。本实验研究表明,虽然SLO跨膜结构和SLO活性结构域缺失,都能使得化脓性链球菌丧失SLO溶血活性,降低其部分毒力。但跨膜结构的缺失同时影响了化脓性链球菌的SpeB的成熟以及对宿主细胞的粘附和损伤,使得化脓性链球菌毒力能够进一步降低。