球孢白僵菌萌发和毒力标记物及外源基因对其代谢组影响
作者单位：安徽农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：胡丰林
授予年度：2013年
主 题：B.bassiana 液质联用 代谢组学 工程菌株 萌发 毒力
摘 要：本研究用基于HPLC-MS的代谢组学方法研究了球孢白僵菌(Beauveriabassiana)转aaIT基因的工程菌株与野生型菌株的代谢物差异，以期了解外源基因对代谢的干扰。并且用同样的方法识别了球孢白僵菌的萌发和毒力标记物，这将有助于提高B. bassiana菌株的筛选速率和产品质量控制。 1外源基因对球孢白僵菌的代谢影响 B. bassiana被广泛用于防止各种害虫，但致死率低和对环境敏感使它的应用受到限制。采用生物工程技术将蝎毒素基因aaIT转入野生B. bassiana菌株能显著提高其毒力，但这种外源基因对B. bassiana的代谢影响目前并不为人所知。为此，我们首次应用高分辨液质联用并结合多变量统计分析的代谢组学方法对B. bassiana工程菌株与野生菌株的菌丝和孢子代谢轮廓进行了分析。PCA和OPLS-DA的分析结果显示，工程菌株和野生菌株的菌丝和孢子代谢物都存在显著差异，表明外源基因插入强烈影响了B. bassiana的代谢。聚类分析结果进一步证实了工程菌株与野生菌株的代谢具有显著差异。差异代谢物包括ergothioneine、glyoxylate、pyruvic acid、fumarate、betaine, carnitine、acetylcarnitine、fatty acids、 glycerophospholipids、 trehalose、 beauverolides、 glutamic acid、sphinganine、dimethyl guanosine等，其中最为显著的是脂肪酸和磷酯类代谢物普遍减少。代谢途径分析发现上述菌丝中大部分成分变化与氧化胁迫及能量代谢有关，如：转基因菌丝中，甘油磷脂、脂肪酸的减少以及氧脂的增加分别与脂肪酸的β氧化和脂肪酸的加氧反应有关;大量的脂肪酸氧化产物acetyl-CoA诱导了isocitrate lyase的表达促进了glyoxylate的生成;部分acetyl-CoA还通过acetylcarnitine进入了三羧酸循环，用于AaIT、beauverolides和其它化合物的合成;此外，大量acetyl-CoA还激活了pyruvate carboxylase，促进糖异生代谢，使trehalose含量升高。这些代谢物变化揭示了细胞中氧化反应的增强。相应的，细胞内的氧化胁迫保护剂，如ergothioneine、trehalose含量的增加表明菌丝细胞受到氧化胁迫并且细胞的保护反应被诱导。工程菌株中糖、脂、肉碱的改变表明B. bassiana的能量代谢受到了外源基因的干扰。能量代谢是物质代谢的动力，可能正是因为转基因菌株的能量代谢受到扰动，使得菌丝代谢物出现了全面调整。与菌丝相比，转基因菌株的孢子中除了同样有明显的磷酯类代谢物降低外，其它与氧化胁迫有关的代谢物，如carnitine、oxylipin、trehalose、mannitol等要么没有明显变化要么含量下降，表明外源基因对细胞产生的氧化胁迫是在其转录和翻译的过程中产生的，当外源基因在孢子中处于休眠状态时，没有明显的氧化胁迫作用。 2球孢白僵菌的萌发和毒力标记物的识别 B. bassiana广泛用于农业害虫的防治，其孢子萌发率和对昆虫的毒力是判断其应用价值的重要指标。本研究对B. bassiana7个菌株的孢子进行萌发率和对茶毛虫毒力进行测定，同时对其菌丝和孢子的代谢物进行LC-MS分析，采用基于LC-MS的代谢组学方法识别菌丝和孢子中与萌发和毒力有关的标记物。结果表明高毒力菌株的菌丝中具有高含量的carnitine、hercynine、acetylcarnitine、α,α-trehalose;Octa-Me、arg-arg-gln、PE(18:2/0:0)、PC(18:3/0:0) and PC(18:2/0:0))。高萌发率的孢子中具有高含量的2,3-dimethylmaleate、 acetylcarnitine、propionyl-carnitine和PC(18:2/0:0)。高毒力的孢子中具有高含量的histamine、V-PYRRO/NO、carnitine、acetylcarnitine、propionyl-carnitine、butyryl carnitine、PE(18:2/0:0)、PC(16:1/0:0)和PC(18:3/0:0)。此外，通过对菌丝中各种杀虫肽beauverolides，beauvericins和bassianolide的含量比较，发现单独一种肽的含量高低与菌株对茶毛虫的毒力没有直接关系，但高毒力Bb1898中的9种肽同时具有较高的含量暗示它们可能发挥协同作用。本研究发现毒力和萌发的共同标记物是脂酰肉碱和磷脂，它们具有维持附着胞膨压和为穿透寄主提供
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