PI3K/Akt/mTOR信号通路在巨噬细胞自噬及动脉粥样硬化斑块不稳定中的作用

作     者：王和峰 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李继福;陈文强

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：PI3K//Akt/mTOR 巨噬细胞 自体吞噬 易损斑块 

摘      要：最新大量证据证实动脉粥样硬化(AS)的发生发展是一种慢性炎症过程,并且AS斑块的急性炎症是导致斑块破裂,促进急性冠脉综合征(ACS)发生的关键因素。炎症反应是导致斑块易损性的最重要的内在因素之一,而易损斑块中的巨噬细胞是导致斑块炎症反应的关键因子。因此,如何减少斑块中的巨噬细胞的浸润,促进易损斑块的稳定已引起国内外学者的高度重视。 研究发现AS斑块中巨噬细胞的变化与细胞的自体吞噬关系密切,AS的发生、发展过程与自体吞噬有关。自体吞噬是保持细胞稳态重要的过程,可以被饥饿、病原入侵、细胞分化以及正常生长的调节所诱导。自体吞噬表现为细胞生长过程中形成的能够降解长寿命蛋白以及自体多余的或失去功能的细胞器的功能。研究发现PI3K/Akt/mTOR信号通路在白体吞噬中发挥关键的调节作用,针对该信号通路选择抑制性药物治疗肿瘤已经取得较为满意的效果。本研究拟选择Akt抑制剂康士德、mTOR抑制剂雷帕霉素及mTOR-siRNA选择性抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,促进巨噬细胞自噬,探寻抑制斑块炎症的可能机制和稳定易损斑块治疗的新策略。 目的： (1)初步验证PI3K/Akt/mTOR信号通路是调节动脉粥样硬化形成以及斑块易损和破裂过程中巨噬细胞自体吞噬的相关通路;(2)初步探讨选择性抑制PI3K/Akt/mTOR传导通路,可以通过促进巨噬细胞的自体吞噬的方式减少易损斑块中的巨噬细胞,进而稳定动脉粥样硬化易损斑块。 研究方法： 利用蛋白激酶B (Akt)抑制剂康士得(Casodex)(20μmol/L)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)(10nmol/l)及mTOR-siRNA (30nmol/l)体外处理鼠巨噬细胞株RAW264.748h后,透射电镜观察巨噬细胞自噬体的变化,细胞免疫荧光法及Western blotting法检测自体吞噬微管相关蛋白LC3-Ⅱ表达,实时荧光定量qPCR和Western blotting法检测Akt、mTOR及自噬相关基因Bekin-1的表达,ELASA检测巨噬细胞分泌炎症因子水平。体内实验中,24只雄性新西兰兔给予球囊损伤十1%胆固醇喂养8周,然后随机分为对照组、康士得组(1.0mg/kg/d)、雷帕霉素组(0.5mg·kg-1·d-1),每组8只,干预4周。血管内超声(IVUS)检测斑块的影像学特征,透射电镜观察斑块中巨噬细胞超微结构的改变,免疫荧光法检测微管相关蛋白LC3-Ⅱ表达,免疫组织化学法检测巨噬细胞Akt、mTOR的蛋白表达。 结果： 与对照组比较,康士得、雷帕霉素及mTOR-siRNA干预巨噬细胞后,透射电镜下观察到自噬体明显增多,微管相关蛋白LC3-Ⅱ、自噬相关基因Beclin-1的表达水平明显上调,而Akt及mTOR的mRNA及蛋白表达水平明显减少,巨噬细胞分泌的IL-10明显降低,而IFN-γ干扰素的分泌显著增加。体内实验：血管内超声(IVUS)显示,与对照组比较,康士得组及雷帕霉素组的血管外膜面积(EEMA)、斑块面积(PA)及斑块负荷(PB)明显减少,透射电镜下观察到巨噬细胞中自噬体增加,组织免疫荧光法示LC3-Ⅱ明显增加,HE染色显示斑块纤维帽的厚度明显增加,内中膜厚度显著减低,组织免疫组化染色显示巨噬细胞RAM-11及mTOR染色显著减少。 结论： (1)体外研究中我们成功建立了巨噬细胞自噬的体外研究模式,巨噬细胞与药物共培养的结果显示：药物以及mTOR基因RNA干扰选择性抑制PI3K/Akt/mTOR传导通路对巨噬细胞的自我吞噬有促进作用。 (2)体内研究中我们成功建立了动脉粥样硬化易损斑块的动物模型,结果显示药物选择性抑制PI3K/Akt/mTOR传导通路能够通过诱导巨噬细胞自体吞噬,减少巨噬细胞在斑块中的浸润和减轻炎症反应,可以使动脉粥样硬化的易损斑块更加稳定。