MT及其突变体aa基因在水花生中的整合与表达

作     者：袁燕 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王捍东;王宗元;茹炳根

授予年度：2004年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：金属硫蛋白 MT aa 转基因水花生 Cd 

摘      要：哺乳动物金属硫蛋白(Metallothionein，简称MTs)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白，在动物体内主要参与必需金属离子的代谢和有毒重金属的解毒等过程。小鼠MT-I具有α和β两个结构域，它们不仅在结构和功能上具有相对独立性，而且对某些重金属具有不同的亲和力：其中α结构域对Cd等离子的结合力要大于β结构域，而对于Zn等离子正好相反。本实验室利用蛋白质工程技术获得了含有两个α结构域的重组体蛋白α-KKS-α，并在体外证明了其对Cd等重金属的亲和力强于天然MT蛋白。本工作利用植物基因工程的方法，使MT及其αα蛋白在水花生中表达，期望在体内研究αα的生物学功能;并且利用MT解毒重金属的特性，提高水花生对Cd等重金属的抗性和积累能力，从而开发出新型植物用于环境重金属污染的生态修复。 1．水花生组织培养的研究 以水花生为试材，将水花生的不同器官外植体接种在不同基本培养基和添加不同激素种类及其浓度配比的培养基中培养，研究外植体、培养基、外源激素对愈伤组织诱导的影响。水花生的茎段、叶、根作为外植体，以1／2 MS、B、MS(1／2)和MS为基本培养基，附加不同浓度的外源激素：BA 0.5～5.0 mg／L，ZT 0.5～4.0 mg／L，NAA 0～0.2 mg／L，IAA 0～0.5 mg／L。实验结果表明，作为培养基1／2 MS比B、MS(1／2)和MS更适合愈伤组织的生长;茎、叶为适宜组培的器官，并且茎段优于叶;BA、ZT、NAA、IAA的各种组合均可启动外植体的脱分化过程，导致叶和茎段愈伤组织的产生和增殖，NAA不变，随BA浓度上升，愈伤组织的诱导率上升。NAA／BA的比值越大越有利于根的分化。 2．水花生遗传转化体系的建立 以水花生生长点为材料，研究了农杆菌介导的水花生生长点的转化体系。实验表明，4.0 mg／L PPT或150 μmol／L Cd可以作为水花生生长点芽分化的选择压，当农杆菌的浓度为OD=0.2～0.4时，农杆菌浸染10 min左右，水花生生长点PPT抗性芽的再生频率最高，达到70％左右。通过以上实验，建立了水花生生长点遗传转化体系。 3．金属硫蛋白MT及其αα基因在水花生中的整合与表达 鉴定了含有MT及其αα基因的植物高效表达载体，冻融法转入农杆菌EHA105，通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)浸染水花生生长点的方法，将MT及αα基因导入水花生中，在含有除草剂或镉的培养基上筛选，获得抗性植株。转化生长点不需要经过愈伤组织阶段而直接从生长点再生成芽，在不含有植物激素，附加4.0 mg／LPPT或150μmol／L Cd的1／2 MS培养基上再生频率较高，但是生长点的转化频率极低。在所有的转化实验中，共浸染了1364个生长点，通过PCR和Dot blot印迹分析仅得到两株转基因植株，初步证明通过农杆菌浸染水花生生长点的方法可以使MT及其αα基因在水花生中进行整合和表达。比较对照、转MT及其αα基因的植株对重金属Cd的抗性，发现转基因植株对Cd的抗性高于对照。转MT及其αα基因的植株在300 μmol／L Cd中均能正常生长，而对照在300μmol／L Cd中生 扬州大学硕士学位论文 长就受到了抑制。 ***2+污染对水花生生理生化指标的影响通过设置不同C矛+污染浓度的水 体，研究了cd2+污染对水花生(A Iternanthera Philoxero比les洲art.)Griseb.)生理生 化指标的影响.实验结果显示，Cdz+各处理浓度均抑制水花生生长，C矛+处理最初 诱导SOD、POD活性升高，但随浓度加大、时间延长，酶活性急剧下降;CAT活 性持续降低，MDA大幅度上升是cdz+培养水花生突出的生理变化之一，450 omo讥 Cd2+培养sd时MDA为对照的346%.