Mt2调控单核巨噬细胞极化对脓毒症小鼠脏损伤的保护作用研究

作     者：曾江华 

作者单位：成都医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：刘月明

授予年度：2018年

学科分类：100218[医学-急诊医学] 1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：脓毒症 脂多糖 金属硫蛋白 炎症 单核巨噬细胞极化 

摘      要：目的:探讨MT2对单核巨噬细胞极化的调控作用,揭示MT2调控炎症反应的可能作用机制,为阐明MT2对脓毒症脏器损伤的保护作用机制提供理论依据。方法:1.脓毒症动物模型的制备取健康SPF级6-8周龄雌性C57BL野生型小鼠24只(WT)及对应MT2敲基因小鼠24只(KO),采用随机数字表法分为:对照组、LPS6小时组(LPS6h)、LPS12小时组(LPS12h)、LPS24小时组(LPS24h),每组均含野生型小鼠及敲基因小鼠各6只。采用腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)10mg/Kg剂量制备脓毒症小鼠模型,对照组注射等量生理盐水。***2对脓毒症小鼠炎症因子和氧化还原水平的影响分别于LPS染毒后6h、12h、24h 4%水合氯醛(0.15mL/20g)腹腔注射麻醉后心脏取血制备血清,采用ELISA检测血清中MT2、MDA、SOD、促炎细胞因子TNF-α、IL-6及抗炎细胞因子IL-10、TGF-β含量。***2对脓毒症小鼠脏器损伤及巨噬细胞极化的作用颈椎脱臼法处死各组小鼠,提取肝脏、肺脏、小肠组织。4%多聚甲醛固定,常规脱水、脱蜡包埋切片。HE染色观察各脏器病理改变,免疫组化检测F4/80蛋白表达。提取肝脏总RNA,采用qPCR检测MT2、M1型巨噬细胞标志物(iNOS、IL-6、TNF-α、IL-1β)及M2型巨噬细胞标志物(Arg1、IL-10、TGF-β、chi3l3)表达水平。提取对照组及LPS24小时组小鼠腹腔巨噬细胞,通过流式细胞仪分析F4/80+CD11c+细胞(M1型巨噬细胞)及F4/80+CD11c-CD206+细胞(M2型巨噬细胞)百分比。***2对小鼠骨髓源巨噬细胞极化的影响采用小鼠骨髓巨噬细胞(分别来源于敲基因小鼠及野生型小鼠),经5μg/L LPS处理24h后收集培养基采用ELISA检测培养基中促炎细胞因子TNF-α、IL-6及抗炎细胞因子IL-10、TGF-β含量;收集细胞:提取总RNA,采用qPCR检测M1型巨噬细胞标志物(iNOS、IL-6、TNF-α、IL-1β)及M2型巨噬细胞标志物(Arg1、IL-10、TGF-β、chi3l3)表达水平;采用流式细胞仪分析F4/80+CD11c+细胞(M1型巨噬细胞)及F4/80+CD11c-CD206+细胞(M2型巨噬细胞)百分比。结果:***2对LPS诱导的脓毒症脏器损伤保护效应(1)对照组野生型小鼠血清中MT2的含量及肝脏MT2 mRNA表达明显高于敲基因小鼠,差异具有统计学意义(P0.01)。注射LPS后野生型小鼠体内MT2含量显著增加,并呈现明显时间依赖性,对敲基因小鼠MT2无明显影响。(2)与对照组相比,注射LPS后两种基因型小鼠均出现倦怠、厌食、行动能力下降,并随着给药时间延长呈加重趋势。未见两种基因型小鼠在上述行为间存在差异。(3)对照组中两种基因型小鼠血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-6及抗炎细胞因子IL-10、TGF-β含量相近,无显著差异。LPS染毒后两种基因型小鼠血清中促炎细胞因子及抗炎细胞因子均显著增加,促炎细胞因子在6h达到高峰,6h后随作用时间延长递减,而抗炎细胞因子随作用时间延长呈递增趋势。相同时间点,敲基因小鼠血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-6的含量明显高于野生型小鼠(P0.05),抗炎细胞因子IL-10、TGF-β的含量显著低于野生型小鼠(P0.05)。(4)对照组中,两种基因型小鼠血清中MDA、SOD含量相近,LPS染毒后两种基因型小鼠血清中MDA含量随作用时间延长递增,SOD活性随作用时间延长递减;相同时间点,敲基因小鼠与野生型小鼠相比,敲基因小鼠血清中MDA增加更显著,在12h、24h差异具有统计学意义(P0.01或P0.001),而SOD活性降低更显著,在24h差异具有统计学意义(P0.05)。(5)HE染色显示经LPS处理后两种基因型小鼠肝脏、肺脏、小肠均出现大量炎症细胞浸润、细胞变性坏死、组织充血水肿等病理改变,并随作用时间延长呈加重趋势,敲基因小鼠与野生型小鼠比较,病理改变较野生型小鼠明显。***2对脓毒症小鼠各脏器巨噬细胞分布的影响免疫组化结果显示两种基因型小鼠各脏器F4/80+巨噬细胞分布与LPS作用呈明显时间依赖性,相同时间点敲基因小鼠F4/80+巨噬细胞浸润程度明显强于野生型小鼠。***2对脓毒症小鼠巨噬细胞极化的影响(1)qPCR结果显示对照组中两种基因型小鼠体内M1、M2型巨噬细胞标志物表达水平相近,无显著差异,LPS染毒后6h M1型巨噬细胞标志物表达达到高峰,后随时间增加逐步减少,而M2型巨噬细胞标志物表达随作用时间逐步增加;相同时间点,敲基因小鼠体内M1型巨噬细胞标志物iNOS、IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平明显高于野