蝙蝠感染丝状病毒的血清学调查

作     者：蔡建秋 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：涂长春

授予年度：2017年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：蝙蝠 丝状病毒 核蛋白 间接ELISA 交叉反应 

摘      要：丝状病毒(Filovirus)属于单股负链RNA病毒目(Mononegavirales),目前包括三个属,分别为埃博拉病毒属(Ebolavirus)、马尔堡病毒属(Marburgvirus)和库瓦病毒属(Cuevavirus),前二个属主要分布于非洲,后一个属分布于欧洲。丝状病毒,对人具有高度的传染性和致死性,所以国际上将该科一些成员列为潜在的生物战剂,例如扎伊尔埃博拉病毒(Zaire Ebola virus,ZEBOV)和马尔堡病毒(Marburgvirus,MARV)。除了雷斯顿埃博拉病毒(Reston Ebolavirus,REBOV)的自然宿主是猪以外,其余已知的埃博拉病毒、马尔堡病毒以及库瓦病毒的自然宿主是蝙蝠。我们实验室于2015年首次在亚洲(中国云南省)发现了新型蝙蝠丝状病毒,说明亚洲地区的蝙蝠也有丝状病毒的分布,但其种类、感染率以及公共卫生意义尚不明确,而我国蝙蝠种类和数量繁多,因而建立一种快速、高效和准确的蝙蝠丝状病毒感染血清的检测方法并以此开展血清流行病学调查具有十分重要的科学意义。本研究为了建立检测MARV、REBOV、ZEBOV、库瓦病毒(Lloviu cuevavirus,LLOV)以及新型丝状病毒DH04株的血清抗体间接ELISA方法,首先构建以上五种病毒核蛋白(NP)羧基端的原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,结果MARV、REBOV、ZEBOV和DH04四种病毒NP蛋白表达成功,鉴定为可溶性蛋白,并可与Anti-His单抗进行特异性反应,说明蛋白表达正确。然后,分别以纯化的目的蛋白为抗原包被96孔ELISA板,建立了检测四种病毒血清抗体的间接ELISA方法:优化抗原包被量为2μg/ml、封闭液为5%脱脂奶粉、二抗稀释度为1:20000。建立的ELISA方法与一种蝙蝠轮状病毒、三种蝙蝠和人的布尼亚病毒(来宾病毒、汉城病毒、春山病毒)蝙蝠感染血清均无交叉反应,证明特异性良好;并能检测1∶1 600稀释的阳性血清,说明敏感性良好;试验的批内及批间变异系数均小于10%,重复性良好。用建立的间接ELISA方法检测了云南、广西以及浙江3个地区的蝙蝠血清,总体阳性率为45.2%(141/312),其中云南阳性率明显高于其它两个省份(P0.05),浙江与广西的阳性率无明显的统计学差异。云南阳性率为65.7%(94/143),其中与DH04、REBOV、ZEBOV和MARV反应的血清分别占46.9%、36.4%、29.4%和21.0%;广西阳性率26.2%(32/122),与REBOV反应的血清最多,占16.4%,其次是DH04和ZEBOV,分别占10.7%和9.8%,MARV最少,仅占4.1%;浙江阳性率为31.9%(15/47),有27.7%的血清针对DH04反应,6.4%的血清针对ZEBOV反应,4.3%的血清针对MARV反应,2.1%的血清针对REBOV反应。根据ELISA检测结果,挑选75份蝙蝠血清,其中59份阳性血清,16份阴性血清,进行Western blot(WB)检测,发现ELISA检测为阳性的蝙蝠血清与WB检测的符合度在80%-100%之间,ELISA检测为阴性的血清与WB检测的符合度在78%-94%之间。使用单抗进行交叉反应确定,证明DH04不与REBOV、ZEBOV、MARV的抗体反应,MARV与REBOV、ZEBOV之间有较弱的交叉反应,REBOV和ZEBOV之间有很强的交叉反应。本研究成功表达了DH04、MARV、REBOV和ZEBOV的NP羧基端蛋白,在此基础上建立了检测四种丝状病毒感染血清抗体的间接ELISA方法,并对我国南方蝙蝠血清进行了丝状病毒的血清流行病学调查,结果表明我国蝙蝠存在比较广泛的丝状病毒感染,而且可能存在多种丝状病毒混合感染的情况,同时不同病毒在不同地域和蝙蝠种类上具有一定的特征:在云南和浙江DH04流行最广,而在广西REBOV流行最广;棕果蝠阳性率显著高于其它四种蝙蝠,马铁菊头蝠中针对DH04反应的血清最多,小黄蝠中针对REBOV反应的血清最多,而在南长翼蝠中未检测到阳性血清。本研究提示我国面临蝙蝠将自身携带的丝状病毒传播给其它动物的潜在风险,为了防范蝙蝠源丝状病毒病未来需要加大对蝙蝠丝状病毒病原的监测和防范措施的研究力度。