基于无花果蛋白酶过氧化物模拟酶活性在生物检测中的分析应用

作     者：庞妍娇 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郑鹄志

授予年度：2018年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 

主      题：无花果蛋白酶 过氧化物模拟酶 分析应用 检测 

摘      要：过氧化物酶(peroxidase;POD,EC 1.11.1.x)是一类以血红素为辅基,并广泛存在于动物、植物、微生物中的天然酶。它因具有特异性强、灵敏度高等优点,在蛋白质、多肽、激素、病毒、寄生虫、生物降解及神经系统等方面都广泛被应用。迄今为止,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)是一种被广泛研究的过氧化物酶,它能催化HO氧化某些电子供体底物,如邻苯二胺(OPD)、对苯二甲酸(TA)及鲁米诺等产生颜色、荧光或化学发光等性质的变化。HRP作为一种重要的商品化诊断试剂,常常被用于生物学研究,但是由于其价格昂贵,使用条件苛刻,严重制约了其在生产实践中的应用。无花果蛋白酶作为一种从无花果树乳胶和未成熟的无花果中提取出的巯基蛋白酶,已被发现它不仅具有蛋白酶活性还具有过氧化物模拟酶活性,它也能够催化HO或过氧化物氧化有机底物生成具有特定颜色或荧光的产物。此外,无花果蛋白酶除了具有与天然酶HRP类似的最适反应条件外,它还能够在较宽的酸碱环境、温度范围以及抑制剂存在条件下保持较高的催化效率,且价格也相对便宜,因此它也被广泛用于环境、生物及医学等各领域的分析检测。在本文中,基于无花果蛋白酶的过氧化物模拟酶活性,我们构建了比色分析方法对葡萄糖的检测以及不同荧光分析方法对多巴胺的检测。(1)基于具有过氧化物模拟酶性质的无花果蛋白酶,并结合葡萄糖氧化酶,利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖产生HO,然后,无花果蛋白酶催化HO氧化过氧化物底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)发生蓝色反应,并在652 nm处出现吸收峰,我们建立了一种简单、灵敏的比色分析方法检测葡萄糖。该方法检测葡萄糖的线性范围是2.0-100μM,检出限是0.5μM,并成功用于人血清中葡萄糖含量的测定。此外,为了拓展无花果蛋白酶的生物应用,我们将无花果蛋白酶固定在氨基修饰的SiO@FeO纳米粒子表面,经磁分离后能够用于循环检测葡萄糖,为无花果蛋白酶在生物医学、生物技术和环境化学等领域提供了广阔的应用前景。(2)多巴胺(DA)作为一种由大脑分泌的儿茶酚胺类神经递质,被认为是临床上精神类疾病检测的重要指标。无花果蛋白酶作为过氧化物模拟酶,能催化HO分解产生·OH,进而氧化底物酪胺生成有荧光信号的荧光酪胺二聚体,当加入DA后,由于DA具有还原性,会与酪胺竞争·OH,导致酪胺的氧化反应被抑制,体系荧光强度降低。因此,我们构建了基于Ficin-HO-酪胺的竞争反应荧光检测脑脊液中的多巴胺。在最佳条件下,该方法检测DA的线性范围是0.05-12.0μM,检出限为46 nM,表明该方法在生物和化学中对DA检测具有巨大的潜力。(3)聚多巴胺纳米粒子(pDA NP)作为一种高分子材料,由于其优良的物理化学性能,已被广泛应用于各个领域。在此,我们利用无花果蛋白酶作为过氧化物模拟酶,催化HO氧化DA形成多巴胺的醌类衍生物并自动聚合,原位合成了荧光聚多巴胺纳米粒子。在一定范围内,随着多巴胺浓度的增加,体系的荧光强度越强,据此我们建立了一种荧光分析方法检测多巴胺。在最佳实验条件下,该方法检测多巴胺的线性范围为10 nM-5.0μM,检出限为5.5 nM。此外,由于该方法灵敏度高,选择性好,已经被成功用于血清中DA含量的检测,基于优异的分析性能,该方法有望用于多巴胺相关的疾病检测。