小反刍兽疫检测方法的建立和初步应用

作     者：毛立 

作者单位：新疆农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：才学鹏;岳城

授予年度：2010年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：小反刍兽疫 检测 RT-PCR cELISA 

摘      要：小反刍兽疫是一种跨国传播的重大烈性传染病,主要感染山羊和绵羊等小反刍动物,其发病率和死亡率很高,已经引起广泛的重视。目前小反刍兽疫在世界范围内广泛流行,对我国的养羊业构成严重威胁,因此,开展小反刍兽疫检测技术研究对我国小反刍兽疫病防控具有现实意义。 通过分析小反刍兽疫病毒不同毒株的N基因序列,根据N基因保守区序列设计一对引物,根据羊肌动蛋白基因序列设计另一对引物作为RT-PCR内参,建立了小反刍兽疫RT-PCR诊断方法,预期扩增片段分别为687bp和493bp。通过对RT-PCR条件优化,筛选了最佳反应条件,在此条件下,最低可检测到12 TCID50/mL的病毒RNA。用该方法对人工感染小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株羊的血液样品检测,可扩增出目的基因片断。 将Nigeria 75/1株N基因克隆到pGEX-4T-1载体,诱导表达并优化表达条件,结果表明选择LB培养基、37℃、0.2mM IPTG诱导4h时表达量最大。纯化该重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,采集鼠脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,筛选得到分泌阳性抗体的6株杂交瘤细胞株,制备腹水后测定单抗生物学性质,其中5株单克隆抗体耐热、耐酸碱且效价较高。经检测,筛选出一株适用于建立竞争ELISA方法的单抗,建立了竞争ELISA检测方法,其最佳反应条件为：单抗稀释浓度1：5×104;包被病毒稀释度1：100;血清加入量在2-8μL内均可;包被液为1% BSA稀释液;竞争反应时间为0.5-2h。检测国内176份血清样品,与商品化试剂盒相比,相对敏感性为84%,相对特异性为97.7%。