鞘内注射MRS2211对糖尿病神经痛大鼠脊髓炎症因子和JAK2/STAT3表达及NR2B磷酸化的影响

作     者：周瑞 

作者单位：遵义医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：曾俊伟

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：糖尿病神经痛 小胶质细胞 P2Y13受体 MRS2211 

摘      要：糖尿病神经痛(diabetic neuropathic pain,DNP)是糖尿病患者常见的一种难以治愈的慢性并发症,对患者的生活水平以及心理健康造成不良影响。脊髓背角小胶质细胞激活可以促进炎性因子的合成和释放,这些炎症因子作用于神经元和星形胶质细胞并调节其功能,促进了DNP的发生。近年研究报道,在脊髓背角表达的P2Y13受体激活参与了DNP的发生发展;另外,在糖尿病大鼠脊髓背角小胶质细胞激活的同时,IL-1β(Interleukin-1β,白介素-1β)和IL-6(Interleukin-6,白介素-6)等促炎细胞因子表达上调,这提示糖尿病大鼠脊髓背角小胶质细胞激活可能与炎症反应的发生有关。在糖尿病疼痛大鼠,脊髓背角Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)和信号转导子与激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)表达上调,而且NMDA受体(N-methyl-D-asparticacid receptor,N-甲基-D-天冬氨酸受体)亚型NR2B磷酸化增强,也参与了DNP大鼠的痛觉过敏。然而,目前尚不清楚,脊髓背角P2Y13受体激活是否影响糖尿病大鼠脊髓背角炎症反应,P2Y13受体是否通过调节脊髓背角IL-1β、IL-6、JAK2、STAT3表达以及NR2B磷酸化水平,从而参与糖尿病大鼠DNP的发生或发展。因此,本实验采用在体和离体两个方面,综合实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)、酶联免疫吸附(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)以及免疫印迹(Western blot,WB)技术,观察(1)抑制P2Y13受体对DNP大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6、JAK2/STAT3表达以及NR2B磷酸化水平的影响。(2)在离体状态下,小胶质细胞P2Y13受体激活对小胶质细胞炎症因子IL-6以及JAK2/STAT3表达的影响。目的:1.探讨P2Y13受体参与糖尿病大鼠DNP的机制。2.探讨离体状态下,P2Y13受体拮抗剂MRS2211对ADPβS激活的背角小胶质细胞炎症因子IL-6表达及JAK2、STAT3表达的影响。方法:1.成年SD大鼠随机分为5组(n=8):○1对照组(鞘内注射生理盐水)、○2糖尿病组(糖尿病+鞘内注射生理盐水)、○35 MRS2211处理组(糖尿病+鞘内分别注射10、50和100pmol/L MRS2211)。大鼠单次腹腔注射STZ(streptozotocin,链脲菌素)50 mg/kg,2w后热痛阈明显下降认为造模成功。随后各组大鼠开始鞘内注射生理盐水或不同浓度MRS2211,每日2次,连续4w。在STZ注射前1d、注射后第2、4和6w测定给药后TWL(thermal withdrawal latency,热缩足潜伏期);分别在STZ注射后第2、4以及6w处死大鼠,取脊髓背角,RTFQ-PCR观察P2Y13受体、Iba-1、IL-1β和IL-6表达变化,ELISA观察IL-1β和IL-6含量变化,WB观察JAK2、STAT3和NR2B(p Tyr1336,p Tyr1472)表达变化。2.离体培养3天以内的SD乳鼠脊髓背角小胶质细胞,接种于六孔板(5×107/孔),培养48h。实验分组:○1空白对照组,加入单纯DMEM高糖培养基;○2 ADPβS处理组,加入ADPβS(10μmol/L),作用3h;○3 MRS2211处理组,MRS2211(10μmol/L)预处理20min,加入ADPβS(10μmol/L),作用3h后收集细胞,WB检测Iba-1、IL-6以及JAK2、STAT3表达。结果:1.热痛阈测定结果显示,各组大鼠STZ注射前TWL没有显著差别,注射2 w后TWL明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。随后开始鞘内注射不同浓度MRS2211(STZ注射后第15 d开始),结果表明,鞘内注射MRS2211(10pmol/L、50pmol/L和100pmol/L)2 h后明显抑制DNP大鼠TWL降低(10pmol/L:P0.05;50pmol/L和100pmol/L:P0.01)。连续4w鞘内给予MRS2211(10pmol/L、50pmol/L、100pmol/L)能够缓解STZ注射4w后的TWL降低(10pmol/L:P0.05;50pmol/L、100pmol/L:P0.01),表现出良好的镇痛效应;对STZ注射6w后的痛阈降低缓解效果不明显,说明此时MRS2211镇痛效果不佳。***-PCR结果显示,与正常大鼠相比,DNP大鼠脊髓背角P