骨痹合剂干预大鼠膝骨性关节炎模型介导软骨下骨代谢机制研究

作     者：周柏健 

作者单位：云南中医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：李帆冰

授予年度：2018年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：KOA大鼠模型 骨痹合剂 软骨下骨 

摘      要：目的:复制一种与人类膝骨性关节炎发病过程相似的去双前肢直立联合Hulth法大鼠膝骨性关节炎模型。并从组织病理、蛋白、基因水平探讨骨痹合剂对该模型软骨下骨代谢的可能作用机制。方法:选择孕期15日的合格健康SD大鼠12只,放入不同的笼内饲养,待幼鼠出生。在幼鼠出生后第10天,选取80只健康无畸形的幼鼠,按体重大小排序后随机分成四组:空白对照组(去双前肢直立联合Hulth法大鼠KOA模型组)、生理盐水组、氨糖美辛组、骨痹合剂组,每组20只。四组均在腹腔麻醉下行去除双前肢手术,手术后置于原母鼠饲养笼内继续饲养,在去除双前肢四个月(大鼠4月龄)后右膝关节行Hulth法手术,手术后置于原笼内继续饲养一个月。大鼠5月龄时给予药物干预一个月,骨痹合剂组按5ml/Kg/d,在8点、18点给予骨痹合剂灌胃;氨糖美辛组给予氨糖美辛肠溶片20mg/Kg/d,置于同体积的蒸馏水中待其融化摇匀后,在8点、18点给予灌胃;生理盐水组按5ml/Kg/d,在8点、18点予以生理盐水灌胃;持续干预4周;空白对照组仅正常饮食,不做任何干预。大鼠6月龄时麻醉处死各组大鼠,取右膝关节行-80℃冷冻保存。部分标本通组织病理分析行HE染色及软骨下骨组织形态计量学分析;部分标本采用western blot的方法,检测各组大鼠膝关节软骨下骨中COL-Ⅰ、OPG、RANK的蛋白表达情况;部分标本采用RT-PCR的方法,检查测各组大鼠膝关节软骨下骨中COL-Ⅰ、IL-1β、IL-6、ALP、OPG、RANK的m RNA表达情况。结果:1.右膝关节HE染色的软骨下骨组织形态计量学统计结果显示:氨糖美辛组和骨痹合剂组其软骨下骨骨小梁体积比与空白对照组和生理盐水组比较明显升高P﹤0.05,差异有统计学意义;空白对照组的软骨下骨骨小梁体积比与生理盐水组比较略有降低P﹥0.05,差异无统计学意义;氨糖美辛组的软骨下骨骨小梁体积比与骨痹合剂组相比略有降低P﹥0.05,差异无统计学意义;*** blot法检测各组大鼠膝关节软骨下骨组织结果显示:四组的OPG蛋白表达含量,骨痹合剂组含量最高并且与生理盐水组比较有统计学意义;四组中RANK蛋白表达含量,骨痹合剂组含量最低并且与生理盐水组和氨糖美辛组比较均有统计学意义;四组的COL-Ⅰ蛋白表达含量,骨痹合剂组含量最高并且与生理盐水组、空白对照组及氨糖美辛组比较差异都具有统计学意义;***-Time PCR法检测各组大鼠膝关节软骨下骨基因结果显示:四组的OPG m RNA相对表达量,骨痹合剂组含量最高并且与生理盐水组、空白对照组及氨糖美辛组比较差异都具有统计学意义;四组的ALP m RNA相对表达量,骨痹合剂组含量高生理盐水组、空白对照组低于氨糖美辛组并且骨痹合剂组与生理盐水组的差异具有统计学意义;四组的RANK m RNA相对表达量,骨痹合剂组含量低于生理盐水组、空白对照组高于氨糖美辛组并且骨痹合剂组与生理盐水组、空白对照组的差异均有统计学意义;四组的COL-Ⅰm RNA相对表达量,骨痹合剂组含量最高并且与生理盐水组、空白对照组比较差异均具有统计学意义,与氨糖美辛组比较差异无统计学意义;四组的IL-6 m RNA相对表达量,骨痹合剂组含量低于生理盐水组、空白对照组高于氨糖美辛组并且骨痹合剂组与生理盐水组、空白对照组的差异均具有统计学意义,与氨糖美辛组比较差异无统计学意义;四组的IL-1βm RNA相对表达量,骨痹合剂组含量低于生理盐水组、空白对照组高于氨糖美辛组并且骨痹合剂组与生理盐水组、空白对照组的差异均具有统计学意义,与氨糖美辛组比较差异无统计学意义。结论:骨痹合剂可以降低软骨下骨组织中IL-1βm RNA、IL-6 m RNA的表达,减轻炎症反应,下调软骨下骨组织中RANK m RNA,并上调OPG m RNA、ALP m RNA、COL-Ⅰm RNA的表达,调整骨代谢并促进软骨下骨的修复,可能是骨痹合剂以此为部分机制而发挥延缓SD大鼠膝骨性关节炎软骨下骨退变进程的作用。