丝光绿蝇防御素基因表达的时相差异

作     者：文荻琛 

作者单位：湖南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：程天印

授予年度：2014年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：丝光绿蝇 抗菌肽 防御素 荧光定量PCR 

摘      要：目的：应用荧光定量PCR技术,通过相对定量法测定防御素Lusifensin基因在丝光绿蝇虫卵、幼虫、虫蛹、成虫四期的表达水平,确定防御素基因表达水平最强的时期,为丝光绿蝇防御素进一步的研究和应用提供理论基础。 方法：1.首先利用腐败鱼肉引诱蝇类产卵,将疑似蝇种捕捉并饲养繁殖;然后对获得的单一群落的蝇种进行形态学鉴定和分子学鉴定：(1)形态学鉴定,在解剖显微镜下采集蝇种的形态特征,跟丝光绿蝇的形态特征进行对比;(2)分子学鉴定,提取蝇种的基因组DNA,对其ITS-1基因片段和CAD基因片段进行扩增、电泳、纯化、回收和测序,将测序结果进行同源性比较。2.提取丝光绿蝇卵期、幼虫期、虫蛹期、成虫期的总RNA,通过反转录、扩增、基因克隆及测序等技术得到防御素基因Lucifensin的部分序列,将测序结果进行保守性对比。3.根据测序结果设计荧光定量PCR引物,运用荧光定量PCR技术的相对定量法,以18S rRNA作为内参基因,比较丝光绿蝇四个生长时期的防御素表达活性。 结果：1.显微镜下采集的形态学特征与丝光绿蝇的描述十分吻合。以ITS1-F/ITS1-R为引物进行扩增,预计产物大小为360bp,其测序结果与丝光绿蝇ITS-1基因(登陆号：FJ614858.1)相似度为98%;以CAD-F/CAD-R为引物进行扩增,预计产物大小为272bp,其测序结果与丝光绿蝇CAD基因(登录号：FJ169332.1)相似度为97%,有且只有一条高度相似DNA序列。综上所述,确定蝇种为丝光绿蝇2.基于丝光绿蝇Lusifensin基因设计一对引物,预计产物大小为254bp,其测序结果与丝光绿蝇Lusifensin基因(登录号：HM243535.1)相似度为89%。3.丝光绿蝇的幼虫期防御素Lusifensin基因的表达活性远远高于其他三个时期,其次是成虫时期,防御素基因表达水平从高到低依次为：幼虫时期成虫时期虫蛹时期虫卵时期。 结论：本试验首次克隆及测序了中国湖南地区丝光绿蝇的ITS-1基因、CAD基因和防御素Lusifensin基因,且进行了同源性比较。并应用荧光定量PCR技术比较了抗菌肽防御素Lusifensin基因在丝光绿蝇各个生长阶段中的表达活性差异,为抗菌肽研究的进一步发展提供新思路。