Physisporinus sp漆酶纯化、性质及对染料的脱色研究

作     者：胡一杰（Alhujaily,Ahmad Nashi S） 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马富英

授予年度：2014年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：漆酶 分离纯化 染料脱色 酶学性质 Physisporinus sp 

摘      要：漆酶是一类含铜的氧化还原酶，它能催化酚类化合物，将酚类化合物进行单电子氧化，形成酚自由基，进而产生非酶催化的自由基反应。由于漆酶特殊的催化性能和广泛的底物范围，在生物技术领域中得到广泛的应用。本实验以Physisporinussp.为出发菌株，研究了在液体培养体系下，不同碳源、氮源和诱导物对其产漆酶的影响，对其胞外漆酶进行了分离纯化和酶学特性的研究，并将纯化的漆酶应用于偶氮类染料的脱色，主要结论如下： 本文研究了不同碳源、氮源和诱导物对Physisporinus sp.胞外产漆酶的影响，研究发现最适碳源和最适氮源分别为葡萄糖和胰蛋白胨，藜芦醇为该菌株胞外产漆酶的最佳诱导物。 通过盐析、疏水层析和离子交换层析，可以将胞外漆酶进行分离纯化。通过80%饱和度的盐析操作，漆酶比活为116.4U/mg，收率80.8%，纯化倍数为1.5倍;疏水层析后收率为42.1%，纯化倍数为10.1倍，漆酶比活为781.9U/mg;采用阴离子交换层析，最终的收率为20.4%，纯化19.6倍，漆酶比活为1515.1U/mg。SDS-PAGE结果显示三步分离后的漆酶蛋白达到电泳纯，其表观分子量为62KDa。以ABTS为底物，该漆酶的最适pH值为3.0，最适反应温度为60℃。该漆酶在40℃条件下保持稳定，50℃下保存1h剩余酶活为84%，60℃下保存1h剩余酶活为50%，表现出良好的温度稳定性。该漆酶在pH﹥6.0条件下比较稳定。以ABTS和DMP为底物测定其动力学常数，结果表明，与DMP相比，该漆酶对ABTS显示较好的亲和力，其Km值和Vmax值分别为1.27×10-3和16.87μM/（L﹒min），而以DMP为底物，其Km值和Vmax值分别为2.82×10-3和5.24μM/（L﹒min）。多数的金属离子对漆酶的活性略有提升，而Fe2+、Ni2+、Co2+和Hg2+能显著抑制漆酶的酶活。有机溶剂能够显著抑制漆酶的酶活，其中5%的甲醇抑制效果最弱。 纯化后的漆酶应用于偶氮类染料SY,，DR5B，CB38和DB22的脱色，实验显示在没有介体存在下，该漆酶对四种偶氮染料显示出较低的脱色能力，3小时后四种染料的脱色率分别为13%，2%，7%和12%。然而在丁香醛作为介体的条件下，该漆酶对四种偶氮类染料显示出较好的脱色能力。在丁香醛浓度为0.5mM时，10min该漆酶对SY的脱色率为98%;0.1mM的丁香醛存在下，10min该漆酶对DR5B的脱色率则可以达到97%;丁香醛浓度为0.1mM时，10min该漆酶对CB38和DB22的脱色率分别为53%和48%。然而随着染料浓度的增加，该漆酶对四种染料的脱色效果逐渐降低。