H3K4甲基化酶SET1A甲基化修饰YAP的机制和生物学功能的研究

作     者：廖光红 

作者单位：华东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王平

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：甲基化 SET1A YAP 转录激活 肿瘤 

摘      要：Hippo信号通路是保守的信号级联反应,通过调节细胞增殖和凋亡来调节干细胞特征和控制器官大小,与人癌症发生发展密切相关。哺乳动物中的MST1/2和Lats1/2激酶及其下游的YAP/TAZ转录共激活因子组成了 Hippo信号通路的核心成分。在应答不利的生长条件时,MST1/2与WW45结合并被磷酸化激活,接着磷酸化激活Lats1/2-Mob复合体,然后磷酸化YAP/TAZ,促进它们结合14-3-3,导致滞留在细胞质中,或被继续磷酸化和β-Trcp介导的泛素化降解。反之,YAP/TAZ入核,与转录因子TEAD1-4结合激活下游基因CTGF,IGFBP3,ITGB2等的表达。蛋白质赖氨酸甲基转移酶在组蛋白翻译后修饰中具有关键作用,同时有报道揭示这些酶也调节非组蛋白如p53,RB1和STAT3等的甲基化,在人肿瘤发生中具有重要作用。关于Hippo信号通路各组分的翻译后修饰如泛素化,磷酸化已被各研究者纷纷阐述并逐渐清晰。而我们感兴趣的是甲基化修饰对这一重要信号通路的调节机制及生理功能的影响。在本研究中,我们用YAP的报告基因筛选发现SET1A明显上调YAP报告基因读值,下调SET1A的表达明显下调YAP下游因子mRNA水平或报告基因读值,过表达野生型SET1A则能上调YAP信号,同时构建SET1A活性缺失型并无此功能。接下来,我们通过蛋白质免疫共沉淀方法证实SET1A可直接结合YAP。之前的研究已经证明通过WW结构域,YAP可可以结合含有PPXY motif的蛋白质如Lats1/2等,我们分析SET1A的氨基酸序列,发现SET1A含有PPXYmotif,构建突变体证明SET1A通过其PPXY基序与YAP的WW结构域结合而相互作用。接下来,我们用Pan-methy1的抗体检测,发现内源的YAP赖氨酸可以被甲基化修饰,而且是SET1A特异的。Hippo通路被抑制时,YAP进入细胞核,与TEAD结合,启动下游基因转录,而我们已发现SET1A可以促进这一过程,下调SET1A的表达,YAP在细胞质定位明显增强;同时过表达野生型SET1A质粒可以rescue甚至促进YAP的细胞核定位,而SET结构域缺失的突变体则不能。然后,分析YAP氨基酸序列有类似NES的序列,对该序列进行LA点突变明显抑制YAP出核,而出核运输蛋白CRM1的抑制剂LMB也明显抑制YAP出核;共转SET1A,YAP和CRM1发现SET1A可以抑制YAP与CRM1的结合。因此,说明SET1A通过抑制YAP与出核蛋白结合,进而促进YAP的细胞核定位。然后,我们在细胞水平的实验MTT方法发现:下调SET1A表达可以明显抑制H1299细胞增殖;裸鼠成瘤也证实下调SET1A与下调YAP都抑制成瘤。而且,我们通过TCGA数据分析,发现赖氨酸甲基转移酶SET1A在多种癌症中的表达明显上调;另外分析肺癌病人的免疫组化染色芯片,发现SET1A与YAP在癌组织中都呈阳性染色,有明显的正相关性;病人生存曲线也发现高表达YAP和SET1A的病人存活率明显低于低表达的病人。综上所述,我们发现SET1A可以通过与YAP直接相互作用,对YAP进行甲基化修饰,YAP的出核被抑制,上调hippo下游因子的转录活性,进而加速癌细胞生长和肿瘤发生。