MIJ近交系大鼠雄性不育突变基因初步鉴定

作     者：卢鹤真 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘军须

授予年度：2013年

学科分类：100208[医学-临床检验诊断学] 1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：雄性不育 MIJ大鼠 基因表达谱芯片 差异表达基因 实时荧光定量PCR 

摘      要：目的：全世界大约有10%0%的夫妇被不育所困扰，其中因男性原因引起的不育占到一半，称为男性不育症。男性生殖系统在发育过程中，受到许多功能基因的调控，其中任一基因的功能障碍都可能会导致男性生殖系统的发育异常或不育，而这些调控基因的分子机制尚未完全研究清楚。 目前，研究疾病机制的主要手段仍是借助实验动物模型，自发突变动物模型是在自然条件下发病，疾病的发生、发展与人类相应疾病相似，对研究人类疾病具有重要的价值。MIJ大鼠为河北医科大学实验动物学部成功培育的近交系大鼠新品系，其雄性后代中稳定出现不育个体，经遗传测交试验证实为常染色体上的单一隐性基因突变所致。MIJ大鼠中可育雄性大鼠与雌性大鼠表型均正常，雄性不育大鼠表现为睾丸下降延迟、早期隐睾、生殖器官（睾丸、附睾、阴茎、输精管、前列腺、贮精囊等）发育迟缓、少精、生精障碍等，这与导致人类男性不育的隐睾症、小睾丸症、少精弱精症表型相似，雄性不育大鼠其他器官未见明显病变，因而推测可能存在突变的基因对雄性生殖器官的发育具有重要而特异的作用。MIJ大鼠具有一致的基因型和遗传特性，实验中易取得一致的结果，是进行人类男性不育研究的良好动物模型。本研究通过分析MIJ雄性大鼠中不育及发育正常个体的睾丸组织基因表达谱芯片的差异，筛选出表达差异显著基因，为最终确定不育基因打下基础，为人类男性不育机制的研究提供基础资料。 方法： 1标本组织的取材与处理 取4周龄雄性MIJ大鼠中不育及正常大鼠各5只，分别取左右两侧睾丸组织，液氮冻存。10只大鼠的左侧睾丸组织用于基因芯片杂交，右侧睾丸组织用于后续的实时荧光定量PCR（Real-time PCR）验证芯片结果。 2mRNA提取 Trizol法分别提取雄性MIJ不育大鼠及系内正常大鼠睾丸组织总RNA，采用Qiagen-RNeasy Kit法纯化总RNA，并对总RNA进行质检和定量，分离mRNA。 3mRNA标记与杂交 使用直接逆转录标记的方法，将mRNA逆转录为cDNA探针，并分别用Cy5-dUTP和Cy3-dUTP标记雄性MIJ不育大鼠、系内正常大鼠睾丸组织的cDNA探针。将含cDNA探针的杂交液、芯片变性后，将杂交液滴于芯片点样区，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm封口膜密封，放入42℃杂交箱内杂交16小时。 4基因表达谱芯片结果分析 采用激光共聚焦荧光扫描仪扫描芯片获得芯片原始数据。将预处理后的基因芯片表达数据按t-检验的P-values2或1/2的筛选要求，筛选出显著上调及下调表达的基因。对筛选出的差异表达基因进行基因功能分类注释（Gene Ontology, GO）和代谢通路分析（Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG Pathway），寻找与生殖发育相关的基因，再结合以往文献报道选定出不育突变候选基因。 5Real-time PCR验证表达差异显著的不育突变候选基因 取MIJ不育大鼠和系内正常大鼠睾丸组织RNA进行反转录，实时荧光定量PCR检测筛选出的差异基因表达，对基因芯片结果进行验证。 结果： 1提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：28S和18S核糖体RNA条带清晰，有模糊的5S条带，说明RNA纯度较高、完整性较好。 2基因表达谱芯片分析结果显示差异表达基因328个，其中在MIJ不育大鼠睾丸组织中表达下调基因248个，上调基因80个。差异表达基因GO功能和KEGG Pathway富集分析结果显示，与生殖系统发育相关的基因所涉及的生物过程、细胞组分及信号通路主要包括：雄性生殖器发育、性腺发育、精细胞发育、精细胞凋亡、受精、精子顶体囊及G-蛋白偶联受体蛋白信号转导通路等。结合以往文献报道，我们选定九个下调基因Asb1、Klhl10、Pitx2、Insl3、Zpbp、Zmynd15、Pvrl3、Acr、Plcd4及一个上调基因Igfbp3进行Real-time PCR验证基因表达差异。 3Real-time PCR检测结果显示Asb1、Klhl10、Pitx2、Insl3、Zpbp、Zmynd15、Pvrl3、Acr及Plcd4基因在MIJ不育大鼠睾丸组织中的表达量显著低于系内正常大鼠睾丸组织中的表达量（P0.05），而Igfbp3基因表达量则显著高于系内正常大鼠睾丸组织中的表达量（P0.05），与基因芯片检测结果一致。 结论： 1通过基因表达谱芯片检测分析，雄性MIJ不育大鼠与系内正常大鼠睾丸组织相比基因表达存在明显差异，提示雄性生殖系统发育的病理生理过程复杂，涉及到多种功能蛋白和代谢通路的调控。 2Real-time PCR验证