大枣葛根对酒精性肝病的防治作用和分子机制探索

作     者：申军华 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李芳芳;赵东强

授予年度：2012年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：酒精性肝病 小鼠 病理 SIRT1 CYP2E1 TNF-α 

摘      要：目的：酒精性肝病是长期大量饮酒导致的肝脏损害。酒精性肝病早期仅表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化，该病是我国继病毒性肝炎之后的第二大肝病。 研究显示CYP2E1、TNF-α和SIRT1参与机体的代谢途径、炎症和氧化应激、能量感受三个不同的途径。已经证实CYP2E1在长期大量饮酒时可以诱导其代谢活性增加，一方面加速对酒精的清除，另一方面产生大量的活性氧对肝脏产生损害。在动物模型和嗜酒的人群中均检测到TNF-α血清水平增加，其参与了胶原纤维的沉积和肝硬化，是酒精性肝硬化分子基础。SIRT1与肝细胞能量代谢密切相关，是一个“能量感受分子，能感受机体和细胞的能量代谢。其表达量与NAD+/NADH和乳酸/丙酮酸的比值变化密切相关，当二者比值升高时，SIRT1表达增加，反之亦然。SIRT1在酒精性肝病中发生什么变化呢？ 大枣中含有黄酮类化合物，应用大枣的醇提物可以明显增加内源性抗氧化酶的活力和肝组织中谷胱甘肽的量，研究表明大枣具有保肝作用，能明显减轻肝脏的氧化和硝基化应激及炎症反应，减轻肝损伤。葛根为传统中药，其所含的黄酮具有抗氧化、解酒毒作用。实验显示葛根黄酮可见减少乙醇导致的肠粘膜通透性增加，可以减轻酒精导致的肝脂肪变。 本实验是为了观察大枣和葛根对酒精性肝病的防治作用，并与保肝药物联苯双酯作比较，从病理变化验证它们的抗酒精性肝损伤的效果，并探讨用药后对酒精性肝损伤CYP2E1、TNF-α和SIRT1三种分子变化的影响。 方法： 1.1动物分组 2-3周龄的雄性昆明种清洁级小鼠114只，随机将其分为两组，对照组24只，模型组90只。模型组隔日灌胃酒精饮料8ml/kg，灌胃4周后，对照和模型组各随机取8只处死取材，检测各项指标变化;模型组再次按体重随机分为4组，各组均隔日灌胃酒精饮料8ml/kg。大枣组20只，灌酒之前4小时灌胃大枣提取物0.02g/kg，葛根组20只，灌酒之前4小时灌胃葛根提取物0.01g/kg，联苯双酯组20只，灌酒之前4小时灌胃联苯双酯7.5mg/kg，病理组22只，灌酒之前4小时灌胃等量蒸馏水。灌胃8周末和12周末分批处死小鼠取材。 1.2标本的获取 小鼠股静脉采血后，颈椎脱臼处死，处死前禁食12h。处死后立即取出肝脏，称重后取左外侧叶4%的多聚甲醛固定，另外一部分标本分装在EP管内，-80℃冻存。血标本用于测定生化指标。 1.3CYP2E1、SIRT1蛋白表达的测定 提取肝脏总蛋白，Lowry法测蛋白含量，以β-actin为内参照，用Western-blotting法检测各组CYP2E1、SIRT1的相对表达量。 1.4TNF-α和ALT、AST的测定 提取肝脏总蛋白，Lowry法测蛋白含量，用ELISA试剂盒测定肝组织中TNF-α的相对表达水平。抽取小鼠静脉血，分离上层血清，用转氨酶试剂盒测定血清中ALT、AST表达水平。 1.5数据处理 所有数据均采用均数间的比较，应用SPSS16.0统计软件处理，所有的数据均用均数±标准差（±S）表示，多组间均值的比较用单因素的方差分析。经检验各组方差齐，进一步比较选用LSD多重比较检验，α=0.05或者0.01。经检验方差不齐，进一步组间比较选用DunnettT3多重检验，α=0.05。 结果： 1一般情况 含乙醇液体灌胃初期小鼠出现嗜睡，食欲较差，进食减少，反应迟钝，短时间共济失调，易激惹，皮毛光泽差等，约4周上述症状逐渐改善，对照组无上述改变。 2体重 4周、8周各组体重相比结果无统计学差异（P0.05）。12周时，对照组小鼠体重与病理组、大枣组、葛根组、联苯双酯组相比较重，结果具有统计学意义（P0.05）。 3肝脏的组织病理学改变 对照组HE染色标本见肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶轮廓清晰，肝索排列整齐。细胞内脂肪滴少见，Masson染色未见纤维形成。造模组4周时可见轻度脂肪变性，肝细胞浊肿，胞浆中出现大小不等的脂滴;8周时，细胞索紊乱，胞浆肿大疏松化，其内细胞核固缩，可见肝细胞广泛性的空泡样变性，脂肪变性较4周模型组小鼠增多;12周时，肝细胞点状及灶状坏死较多见，汇管区有炎性细胞浸润，一些坏死区可见明显充血及空泡样变性;16周时，炎症坏死和炎细胞侵润更加明显，汇管区无明显胶原纤维增生。各个治疗组也出现不同程度的病理变化，但病变的程度明显较轻，细胞内脂肪变较少。 4血清AST和ALT 4.1AST 4周时,对照组与病理组血清AST结果相比无统计学差异（P0.05）。8周时,病理组血清AST水平与对照组及各治疗组相比明显增高，结果具有统计学差异(P0.01)。12周时，病