全基因组范围APA分析的复方中药金复康抑癌机制的研究

作     者：寇瑶 

作者单位：西北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈富林

授予年度：2015年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：肿瘤 APA 3’UTR 转录后调控 3T-seq 高通量测序 

摘      要：真核生物的mRNA(组蛋白mRNA除外),以及一些ncRNA、miRNA的成熟都会经过选择性多聚腺苷酸化(Alternative Polyadenylation, APA)形成Poly A尾。APA通过产生不同长度的3’UTR (Untranslated Region),影响着转录子异构体的稳定性、翻译活性和细胞内定位等生物学特性。最近的研究结果显示,在不发生遗传突变的情况下,APA所产生的缩短3’UTR的转录子可以使miRNA结合位点丢失。通过逃逸miRNA负调控而激活的原癌基因促进细胞的恶性转化,从而使miRNA对转录表达的抑制作用缺失。相对的,当介导细胞凋亡基因的mRNA在APA作用下使3’UTR缩短,同样可以避免miRNA的抑制作用,使凋亡基因表达量上调,从而达到抑癌作用。本文即是从这个角度出发,探讨复方中药金复康(JFK)的抑癌机制。金复康是一种特效抗肺癌口服药物,已经获得国家食品药品监督管理总局批准在临床应用于肺癌的治疗。它作为一类黄芪为主的中药复方,已有报道可以提高非小细胞肺癌患者的化疗效果。小鼠体内实验证明金复康可以抑制肿瘤细胞的生长,但其具体的作用机制还不十分清楚,有待进一步深入研究。本文选取金复康乙醇萃取物,作用于人非小细胞肺癌细胞系A549后,通过本实验室独创的用于分析APA的新技术——3T-seq (TT-mRNA Terminal Sequencing)技术,精确定位PAS (Poly A Site)位点,建立APA标签文库。结合高通量测序技术在全基因组范围内构建PAS图谱,并通过生物信息学方法分析金复康对人非小细胞肺癌细胞A549转录后调控的影响。研究发现,A549细胞在金复康作用后APA使一部分肿瘤抑制基因的3’UTR明显截短,并且表达水平上调。分析这些差异性表达基因,如MANF、UBE2Z、SGK223、CKAP4的功能,发现他们都是介导细胞凋亡相关的基因。qPCR验证基因的表达水平,发现加药后这些介导凋亡的基因表达水平上调;3’RACE验证3T-Seq捕获PAS的精确性,经UCSC数据库比对,结果和UCSC上已知的位点完全一致,可证明由3T-seq做出的APA标签数据库的准确性和真实性。由此得出金复康也许是通过影响细胞凋亡相关基因的APA位点,调节这些基因的表达水平,从而抑制肿瘤细胞的生长。本研究对肺癌细胞的基因表达提供了重要的信息,同时为中药抗肿瘤分子机制的研究开拓了新的研究方法和思路。