植物乳杆菌细菌素基因座遗传分析与基因plnEF外源表达研究

作     者：赵美静 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘树文

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：共培养 植物乳杆菌素 基因座 植物乳杆菌 外源表达 

摘      要：植物乳杆菌可以适应恶劣的葡萄酒环境,启动苹果酸-乳酸发酵,具有产生植物乳杆菌细菌素的能力,抑制或杀死葡萄酒中有害乳酸菌,防止葡萄酒的破败,部分替代二氧化硫的作用,从而降低葡萄酒中二氧化硫的使用。因此筛选产细菌素的植物乳杆菌进行苹果酸-乳酸发酵,十分必要。本试验首先通过共培养诱导培养产生细菌素,从14株植物乳杆菌中成功筛选获得两株产细菌素的植物乳杆菌XJ25和PC520。其次,利用两株菌基因组重测序手段,进一步比较分析其植物乳杆菌素(Plantaricin,pln)基因座间存在的差异,获得植物乳杆菌素pln基因座遗传图谱。最后构建基因plnE和plnF的外源表达载体,诱导产生大量重组蛋白,并对其进行初步的纯化。主要研究结果如下:1)14株植物乳杆菌中,菌株XJ25和PC520抑菌范围大,抑菌性较强,且对醋酸菌有一定的抑制作用;植物乳杆菌中共培养现象是普遍存在的,菌株XJ25和PC520与粪肠球菌XJ26M共培养诱导产生细菌素。通过对7株乳酸菌(XJA2,201,205,216,509,594,542)进行16S rRNA及recA基因的扩增分析,鉴定7株菌为植物乳杆菌,并且RAPD分析12株植物乳杆菌随机扩增片段的多态性,表明了其基因组DNA的多态性。2)菌株XJ25和PC520的pln基因座结构相似,均由6个操纵子(plnEFI、pln JKLR、plnGHSTUVW、plnABCD、plnMNOP、plnWXY)组成,其中plnABCD是三组分调节操纵子。并且菌株XJ25和PC520均存在一个新的未知功能的orf1。植物乳杆菌菌株PC520的部分基因(pln Y,pln S)等发生缺失,菌株XJ25的plnF基因编码蛋白在14位(A-S)和42位(V-I)有两个氨基酸突变。3)通过一步定向克隆技术,引物设计与线性质粒两端同源片段,成功将目的片段插入质粒中,转化的效率很高。优化重组蛋白诱导表达条件,选择在18℃,150 rpm,IPTG浓度0.6 mM,诱导时间12 h,进行扩大培养。4)重组蛋白PlnE,PlnF1,Pln F2经AKTA蛋白纯化分析,超滤脱盐等,去除部分杂蛋白,所测蛋白浓度为600-1000 ng/μl,仍需进一步纯化;纯化后蛋白进行抑菌活性检测表明,重组蛋白PlnE和Pln F具有抑菌活性,且蛋白PlnE和蛋白PlnF之间存在协同作用。