池塘养殖牙鲆肠道菌群结构及其与益生菌调控的关系

作     者：李存玉 

作者单位：上海海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：柳学周

授予年度：2015年

学科分类：090801[农学-水产养殖] 0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：牙鲆 肠道菌群结构 16s rRNA MiSeq高通量测序 微生态制剂 

摘      要：本研究从微生态角度出发,对池塘养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)肠道菌群结构及其影响因素进行了初步分析,同时向养殖池塘环境中添加微生态制剂,探索了微生态制剂对池塘环境的改变及养殖牙鲆肠道菌群的应答变化,以期为今后牙鲆池塘养殖专用微生态制剂的研制和养殖环境微生态调控技术构建提供理论依据,同时有利于建立池塘养殖牙鲆健康生长调控技术。本研究主要包括三个部分：工厂化和池塘养殖模式下牙鲆肠道菌群结构的比较分析、益生菌的分离培养及其水质调控效果评价、池塘环境及养殖牙鲆肠道菌群对益生菌调控的响应。主要研究结果如下：1、工厂化和池塘养殖模式下牙鲆肠道菌群结构的比较分析为比较池塘和工厂化养殖条件下牙鲆肠道菌群结构差异及其与饵料、水环境、底质等的关系,采用MiSeq高通量测序技术和生物信息学分析手段,构建了牙鲆肠道、养殖水体、饵料和池塘底泥等7个样品的16s rRNA基因测序文库,分析了不同样品中菌群组成和生物多样性。结果表明：池塘养殖牙鲆肠道(B1)中以厚壁菌门(30.49%)、变形菌门(19.16%)和梭杆菌门(11.11%)为主,其中芽孢杆菌属(27.66%)占绝对优势,弧菌属(0.16%)丰度最小;工厂化养殖牙鲆肠道(B5)中以变形菌门(44.31%)、厚壁菌门(11.57%)和放线菌门(4.79%)为主,其中不动杆菌属(10.37%)丰度最大,弧菌属(4.05%)相对B1中丰度较高。牙鲆肠道优势菌群主要与营养代谢调节相关,同时有益微生物和有害微生物也是肠道菌群的重要组成部分。差异性和系统进化分析表明两种养殖条件下牙鲆肠道菌群结构与饵料中菌群关系密切,此外受养殖水环境中菌群影响较大。池塘养殖模式下牙鲆肠道菌群结构受底质影响相对较小。2、两株益生菌的分离培养及水质调控效果评价筛选了一种微生态制剂,具有较好的养殖水质调控效果。为进一步鉴定其有效成分,综合利用基于细菌16S rRNA基因文库的Miseq高通量测序技术、生物信息学分析方法、细菌纯化培养技术等手段,认识了该种微生态制剂的菌群组成,对可培养的两株优势菌种进行分离纯化,探明了其生理生化特性,鉴定了其分类地位,摸清了适宜的培养条件,验证了实验室条件下的水质处理效果,为下一步益生菌的分离纯化和生产应用奠定了基础。实验结果显示：该微生态制剂中主要的菌群包括肠杆菌属(31.99%)、芽孢乳杆菌属(31.81%)、乳杆菌属(15.8%)、芽孢杆菌属(1.44%)等,另有18.96%的细菌尚未分类。经分离纯化,培养基筛选、形态学鉴别、生理生化反应、分子生物学鉴定,得到植物乳杆菌A、芽孢杆菌B两株有益菌。在实验室条件下摸索两株菌的最适生长条件,结果显示：植物乳杆菌A、芽孢杆菌B的最适生长pH分别为6.5、6.0,最适生长温度分别为30℃、36℃。为了在实验室条件下评价其水质调控能力,采用水杨酸盐法、重氮化作用法、PhodVer3抗坏血酸法分别验证其对氨氮、亚硝酸盐、磷酸盐的降解能力。结果表明：植物乳杆菌A(OD600nm=2.33)、芽孢杆菌B (OD600nm=2.23)培养达到最大密度时,按照10：1混合使用净化水质效果最好,对水体中氨氮、亚硝酸盐、磷酸盐的降解率分别达到了73.1%、57.8%、52.4%。3、池塘环境及养殖牙鲆肠道菌群对益生菌调控的响应为评价一种微生态制剂对池塘养殖水环境及养殖牙鲆肠道菌群的调控效果,采用MiSeq高通量测序技术和生物信息学分析手段,构建了牙鲆肠道、养殖水体、饵料和池塘底泥等4批次22个样品的16s rRNA基因测序文库,分析了不同样品中菌群组成和生物多样性在微生态制剂调控过程中的变化趋势。结果表明,试验期间,微生态制剂对养殖水体中氨氮降解率最高达到88.9%;亚硝酸盐含量降解率最高达到67.9%,磷酸盐降解率最高达到69%。另一方面,池塘水体中叶绿素含量增加了19.05%,拟杆菌门菌群呈增加趋势,变形菌门呈下降趋势;底泥中芽孢杆菌属变化最为明显,由最初的3.78%增加到33.64%。牙鲆肠道中肠杆菌属、军团杆菌属、不动杆菌属均有不同程度的增加,弧菌属相对丰度由最初的0.16%降低到0.05%。另外,还在牙鲆肠道内检测到植物乳杆菌成分。差异性和系统进化分析表明：微生态制剂能有效改善水环境,影响池塘养殖水体、底泥和牙鲆肠道菌群结构的变化。牙鲆肠道优势菌群主要与营养代谢调节相关,通过微生态制剂调控其菌群结构,能够维护牙鲆的健康,促讲生长。