海马内注射Exendin-4改善β淀粉样蛋白诱导的小鼠昼夜节律紊乱及机制研究

作     者：徐云云 

作者单位：山西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王晓晖

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100203[医学-老年医学] 10[医学] 

主      题：Aβ31-35寡聚体 Exendin-4 昼夜节律 机制 

摘      要：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)作为一种常见的神经退行性疾病,临床上主要表现为认知、学习、记忆等功能进行性下降。深入研究发现,250%的AD患者同时伴有不同程度的昼夜节律紊乱症状,主要表现为睡眠-觉醒周期紊乱、日间过度思睡和夜间烦躁不安,这些症状会加重患者的认知行为障碍,严重影响患者的生活质量。AD主要的病理特征为老年斑(Senile plaque,SP)在神经元间隙的沉积、神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)和神经元的丢失。β淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)作为老年斑的主要成分,具有明显的神经毒性作用。研究发现,伴有Aβ沉积的APP/PS1转基因AD小鼠(Transgenic mice with five familial Alzheimer’s disease,5×FAD)表现出明显的昼夜节律紊乱现象。但针对Aβ是否可以直接引起小鼠出现昼夜节律紊乱的研究却较为少见。针对AD的治疗药物层出不穷,但其治疗效果却不尽人意。大量研究表明,II型糖尿病(Type II diabetes mellitus,T2DM)与AD在发病机制和发病过程上关系密切。T2DM的新型治疗药物—Exendin-4不仅具有控制血糖的作用,还能发挥显著的神经保护作用。但Exendin-4对Aβ引起的昼夜节律紊乱是否具有保护作用仍不清楚。因此,本课题的研究目的:(1)观察Aβ31-35对C57BL/6小鼠昼夜节律的影响,并同时观察其对小鼠海马区时钟蛋白CLOCK蛋白的影响;(2)观察Exendin-4对Aβ31-35引起的小鼠昼夜节律紊乱的影响,并观察Exendin-4预注射对小鼠海马区CLOCK的表达的影响,探讨Exendin-4对Aβ31-35引起的昼夜节律紊乱的改善作用。第一部分Aβ31-35引起小鼠昼夜节律紊乱及CLOCK蛋白的异常表达目的:利用小鼠跑轮行为学实验探究Aβ31-35对C57BL/6小鼠昼夜节律的影响,并用western blot方法检测Aβ31-35对小鼠海马CLOCK蛋白表达的影响。方法:健康雄性C57BL/6小鼠随机分为Control组和Aβ31-35组,Control组小鼠双侧海马区注射8.2μL三蒸水,Aβ31-35组小鼠双侧海马区注射8.2μLAβ31-35(15 nmol)。实验开始第1周小鼠处于12 h/12 h光暗循环(Light-dark cycle,LD),随后将光照条件改为持续黑暗(Dark-dark,DD),利用Vital View小鼠跑轮装置,监测各组小鼠的运动状况。2周后将实验数据导出,利用Acti View软件分析每只小鼠的在DD环境中的自由运转周期(Period)、振幅(Amplitude)、节律鲁棒值(Robustness)和平均每小时运动量(Locomotive activity)。黑暗条件下,在不同的CT时间点处死各处理组小鼠,取下海马,加入组织裂解液,冰上剪碎匀浆后,离心,取上清,BCA法测蛋白浓度,计算上样量。加样,电泳,转膜,封闭,洗膜,加一抗,洗膜,加二抗,洗膜,曝光。Image J分析图像条带的灰度值,计算不同CT时间CLOCK蛋白的相对表达量。结果:持续黑暗环境中,Control组小鼠运动存在稳定的昼夜节律,休息相和运动相分界清楚,运动主要集中在主观夜间;Aβ31-35组小鼠运动的昼夜节律较不稳定,休息相和运动相分界不明显,主观白天运动增加,主观夜间运动减少。Control组小鼠自由运转周期为23.51±0.05 hr,昼夜运动振幅为127±14.06圈,节律鲁棒值为54.71%±2.55%,Aβ31-35组小鼠自由运转周期为23.63±0.05 hr,昼夜运动振幅为90.44±18.85圈,节律鲁棒值为22.47%±4.28%,其自由运转周期显著延长(P0.05)。Exendin-4预处理组小鼠平均每小时运动量为796.46±190.75圈,高于Aβ31-35组(P0.05)。海马预注射Exendin-4后,小鼠海马CLOCK蛋白表达节律性部分恢复,在CT8,CT20时表达增高,CT2时表达降低,与Aβ组相比蛋白表达存在显著差异。单独给予Exendin-4后并不会改变海马区CLOCK蛋白的正常表达趋势。结论:海马内预注射Exendin-4后,Aβ31-35引起的运动节律紊乱可以得到部分恢复,说明Exendin-4可以部分拮抗Aβ31-35的神经毒性作用。深入研究发现,Exendin-4可以通过调节CLOCK蛋白的表达来发挥其神经保护作用。