miR-122和miR-449a在草原红牛睾丸组织不同发育阶段的表达规律及其功能

作     者：朱超杰 

作者单位：吉林农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张国梁

授予年度：2016年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：草原红牛 睾丸组织 miR-122 miR-449a DUSP4 FKBP1B 

摘      要：本研究以中国草原红牛为研究对象,采用实时荧光定量PCR方法检测了miR-122、miR-185、miR-146b、miR-140、miR-449a、miR-204、miR-375、miR-221在草原红牛不同发育时期睾丸组织和以及其他组织中的表达差异,筛选出在睾丸中特异表达或倾向表达的miRNA,并通过预测软件对选择对miRNA进行靶基因预测,构建双荧光素酶报告载体。初步阐明这8个miRNAs调控睾丸发育的分子机制,为中国草原红牛公牛发育的遗传机理和在肉牛生产中进行分子育种提供了理论基础。本研究主要结果如下:通过对miR-122、miR-185、miR-146b、miR-140、miR-449a、miR-204、miR-375、miR-221草原红牛不同组织中相对表达量水平分析,它们在各组织中有不同程度的表达,其中mir-122和mir-449a在草原红牛睾丸中相对表达量较高,miR-122、miR-449a在睾丸中具有倾向性表达的特点,而且miR-122在睾丸中的表达量与其它组织相比差异极其显著。这8个miRNA在在不同发育阶段牛睾丸组织中的相对表达量差异显著,miR-221和miR-204在初生牛中相对表达量最高,miR-140和miR-185在12月龄睾丸中表达量最高,miR-449a、miR-375、miR-146b和miR-122在24月龄睾丸中相对表达量最高。这8个miRNA的荧光定量结果与课题组前期出生公牛和24月龄公牛solexa高通量测序结果一致,miR-146b、miR-449a、miR-375和miR-122表达上调,miR-185、miR—140、miR-204和miR-221表达下调。通过软件预测miR-122可能的靶基因有MAF1、PDK4、DUSP4、FUT8、PRKRA,miR-449a可能的靶基因FKBP1B,3 UTR区进行扩增,插入到PGL3-control载体构建构建双荧光素酶报告载体,与pre-mir共同转入牛脂肪细胞中,通过多功能酶标仪检测荧光素酶活性。结果验证,DUSP4和FKBP1B可能分别是是miR-122和miR-449a的靶基因。本研究分析了miRNAs在不同发育阶段睾丸组织及其他组织中的表达差异,预测了睾丸组织中高表达mir-122和mir-449a的靶基因,并进行了体外验证,为以后研究miRNA对肉牛生殖器官的发育及生殖活动的调控机理具有重要作用。