小麦花粉电穿孔法及花药愈伤组织基因枪法遗传转化技术研究

作     者：赵雪晶 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：闵东红

授予年度：2013年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：小麦 花粉 电穿孔转化 花药愈伤组织 基因枪轰击 

摘      要：近年来，作物转基因育种以其打破生殖隔离、准确的改良目标性状、育种效率高等诸多优势，受到广泛的关注，而高效、稳定的遗传转化技术是提高转基因育种效率的前提和关键。探索便捷、快速的小麦遗传转化技术不仅有助于拓展小麦转基因育种的途径，更对加快小麦新品种的培育具有重要的理论和实践意义。 本研究以冬小麦品种济麦19为受体，对扬花期成熟花粉进行电穿孔处理，通过对花粉电穿孔的参数和转化条件的筛选和比较，旨在探索并建立小麦花粉电穿孔法转化技术体系，并利用花粉电穿孔法将Gus基因导入小麦，对获得的转基因T1、T代植株进行PCR、Southern和组织化学染色的检测和鉴定。其次，本研究以小麦品种新春9号的花药愈伤组织为受体，Gus为外源基因，对基因枪转化时的轰击参数进行优化，通过对轰击后花药愈伤组织中Gus基因瞬时表达率的检测，以及对再生植株PCR和PCR-Southern的鉴定，旨在优化以小麦花药愈伤组织为受体的基因枪法转化体系。 本研究得到了以下主要结论： 1.小麦花粉电穿孔转化中，当电场强度为6kV/cm时，花粉细胞经Trypan Red和FDA染色的平均值最高为58.67%，表明电穿孔产生孔洞且有活力的细胞数最多，为最适电场强度;花粉电穿孔处理后冰上保存4h，FDA染色率为92.27%，而室温下保存为69.97%，表明冰上操作可以显著延长离体花粉的活力;当花粉密度为5×106个/mL、去雄后第5天授粉时结实率最高为9.82%，为比较适宜的花粉授粉条件。 2.利用花粉电穿孔法将外源基因Gus转入普通小麦，共授粉112个小花，T1代PCR检测得到2株阳性植株，转化率1.79%;PCR检测T代所有单株，阳性植株为19株，阳性率40.43%;Southern杂交检测结果表明，阳性植株T代的2个株系检测到杂交信号，分别以2和3拷贝整合入小麦基因组，同时取其种胚、幼根、叶片等经过组织化学染色法检测，呈现蓝色反应，表明利用小麦花粉电穿孔转化法可以成功将外源基因整合入小麦基因组中并稳定遗传至T代，且外源基因Gus能够得到表达。 3.利用基因枪轰击法将外源基因Gus转入小麦的花药愈伤组织，对轰击2天后的花药愈伤组织Gus基因瞬时表达率的比较发现，轰击距离为6cm、Gus:Bar=3:1时，瞬时表达率最高，为91.11%;但对再生植株的PCR检测表明，轰击距离为6cm、Gus:Bar=1:1时，共轰击愈伤组织211个，检测得到阳性植株3株，转化率最高，为1.42%。阳性植株经PCR-Southern检测到阳性条带，证明外源基因Gus整合到小麦的基因组中。 通过本研究，初步建立了小麦花粉电穿孔转化法和花药愈伤组织基因枪转化法技术体系，为下一步开展相关功能基因的转化奠定基础。