Rad51在小鼠雄性生殖细胞发育过程中的作用及机制研究

作     者：秦君超 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邵常顺

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：Rad51 生殖细胞 减数分裂 精子发生 同源重组 

摘      要：[研究背景]近年来男性不育发生率快速增加,其中30%患者为病因不明的特发性不育(如非梗阻性无/寡精子症和严重少精子症),而且缺乏有效的治疗措施。因此,深入研究精子发生的分子机制对于阐明不育症的病因具有重要意义。精子发生过程包括精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子的变态分化及成熟等阶段,其受多种激素和众多基因的共同调控。减数分裂(meiosis)是形成单倍体精子细胞的重要环节,而Rad51是参与减数分裂重组修复过程中的关键蛋白。由重组酶Rad51和Dmc1催化的单链入侵、同源配对及链交换是减数分裂重组中最核心的事件。Meiosis I前期,核酸内切酶SPO11催化产生大量的程序性DNA双链断裂(double-strandedDNAbreaks,DSBs),启动减数分裂重组。DSBs形成后形成3’端单链DNA(ssDNA)尾;Rad51和Dmcl结合到ssDNA上形成核蛋白纤维,并介导ssDNA侵入同源双链区域,形成D-loop中间体。在DSBs产生后,同源染色体开始配对、联会,形成联会复合体(synaptonemal complex,SC)。SC既能维持同源染色体的配对,也能作为支架(scaffold)与Rad51和Dmcl结合,促进重组复合物形成并参与减数分裂重组过程。由于全身性敲除Rad51基因的小鼠胚胎期致死,难以利用该动物模型研究Rad51基因在精子发生过程中的作用机制。条件性基因敲除小鼠模型可以避免全身性基因敲除小鼠可能出现的胚胎致死,但目前尚无Rad51的条件性基因敲除小鼠的报道。为了探究Rad51在雄性小鼠生殖发育过程中作用及机制探究,我们开展了以下研究工作:***51在小鼠睾丸中的表达Western blotting方法证明Rad51蛋白在不同日龄小鼠睾丸组织中均有表达,其表达水平从8日龄开始升高,在42日龄时表达水平明显增加,42日龄与96日龄Rad51蛋白的表达水平无明显差异。免疫组化和Real-time PCR方法证明Rad51在小鼠睾丸生殖细胞中高表达。***51条件性敲除小鼠不育我们构建了Rad51条件型敲除小鼠,并将其与DDX4-Cre转基因工具小鼠交配,进而得到从胚胎期15天生殖细胞缺失Rad51基因的雄性小鼠。通过Western blotting和免疫组化确定敲除效果,发现Rad51fl/-;DDX4-Cre雄性小鼠的睾丸体积较对照小鼠减少2/3并出现在小鼠个体发育早期。生育力实验表明其不育。***51条件性敲除小鼠中减数分裂和精原细胞增殖受阻通过染色体铺片和睾丸组织切片免疫荧光检测联会复合体蛋白(SCP-3)和DNA损伤相关蛋白(γ-H2AX),发现在Rad51fl/;DDX4-Cre小鼠中减数分裂过程受阻。采用免疫荧光和免疫组化对增殖相关蛋白Ki-67染色检测生殖细胞增殖,发现在Rad51f/-;DDX4-Cre小鼠中Ki-67表达受损。接下来我们探索精子发生早期精原细胞有丝分裂阶段PLZF表达情况的分析显示PLZF不表达,精原细胞有丝分裂过程受阻。4.检测Rad51条件性敲除小鼠曲细精管中支持细胞因为Rad51fl/;DDX4-Cre小鼠睾丸曲细精管中只含有一层细胞,且精原细胞有丝分裂过程受阻,通过对支持细胞标记物SOX9免疫荧光和免疫组化染色证明了Rad51fl-;DDX4-Cre小鼠睾丸曲细精管中只含有支持细胞,对支持细胞数目的统计学分析发现支持细胞数目明显增多;透射电镜观察法观察支持细胞形态异常,细胞延伸至曲细精管管腔中部,但内部的细胞器未发现异常。***51fl/;凰DX4-Cre小鼠生殖细胞有较高的DNA损伤并且对X射线敏感性增加Rad51fl/;DDX4-Cre小鼠和对照组小鼠照射4GyX射线并释放24小时,检测γ-H2AX结果表明与对照小鼠相比,Rad51fl/+;DDX4-Cre小鼠本底有较高的DNA损伤且睾丸组织对X射线更敏感。