口蹄疫病毒前导蛋白对病毒感染性的影响

作     者：张萌 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：刘在新

授予年度：2014年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：口蹄疫病毒 前导蛋白 嵌合病毒 IFNβ 感染性 转录 影响 

摘      要：口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性热性高度传染性疾病,主要感染猪牛羊等偶蹄动物。FMDV为单链正链RNA病毒,只有一个开放阅读框,其中前导蛋白基因位于ORF的5’端;前导蛋白在影响病毒毒力方面发挥重要作用。口蹄疫病毒前导蛋白长度一般为201aa,国家口蹄疫参考实验室分离到了三株具有不同长度前导蛋白的缅甸98系口蹄疫病毒,其中O/CHN/Mya98/33-P为200aa,O/CHN/Mya98/HN1为201aa,O/GSLX/2010为202aa。 为研究三株口蹄疫病毒前导蛋白对病毒感染性的影响,本研究运用反向遗传操作技术,以O/CHN/93现用疫苗株的感染性克隆为骨架,分别构建了含口蹄疫病毒中国分离株O/CHN/Mya98/33-P前导蛋白Lab、La及Lb的三个嵌合全长cDNA质粒,含O/CHN/Mya98/HN1前导蛋白Lab、La及Lb的三个嵌合全长cDNA克隆,含O/GSLX/2010前导蛋白Lab、La的两个嵌合全长cDNA克隆。这8个嵌合全长cDNA克隆经NotI线化转染稳定表达T7RNA聚合酶的BSR细胞,经过BHK-21细胞传代后,出现明显的细胞病变反应;通过反转录PCR分析,能够检测的嵌合的目的基因序列,并且测序结果符合预期;再利用激光共聚焦显微镜观察,明显检测到病毒非结构蛋白3A的表达,表明嵌合口蹄疫病毒的拯救成功,分别命名为rOP33Lab(嵌合O/CHN/Mya98/33-P株口蹄疫病毒前导蛋白Lab),rOGSLXLab(嵌合O/GSLX/2010株口蹄疫病毒前导蛋白Lab),rOHN1Lab(嵌合O/CHN/Mya98/HN1株口蹄疫病毒前导蛋白Lab),rOP33La(嵌合O/CHN/Mya98/33-P株口蹄疫病毒前导蛋白La),rOGSLXLa(嵌合O/GSLX/2010株口蹄疫病毒前导蛋白La),rOHN1La(嵌合O/CHN/Mya98/HN1株口蹄疫病毒前导蛋白La),rOP33Lb(嵌合O/CHN/Mya98/33-P株口蹄疫病毒前导蛋白Lb),rOHNlLb(嵌合O/CHN/Mya98/HN1株口蹄疫病毒前导蛋白Lb)。 八株不同的嵌合病毒感染猪肾原代细胞,利用实时荧光定量PCR检测病毒RNA和宿主IFNβ和OAS mRNA增殖情况。其中嵌合病毒rOP33Lab,rOGSLXLab, rOHN1Lab三者相比,rOP33Lab增殖速率较快,而其诱导产生的IFNβ及OAS mRNA含量最低;rOP33La, rOGSLXLa, rOHN1La三者相比,他们抗宿主产生IFNβ的能力基本一致,但是rOP33La增殖速率最快;rOP33Lb与rOHN1Lb两者相比,rOP33增殖速率较快,抗宿主转录IFNβ及OAS mRNA的能力更强。总上结果表明口蹄疫病毒O/CHN/Mya98/33-P株前导蛋白La能够增强病毒的复制,前导蛋白Lb具有较强的抗宿主转录IFNβ及OAS的能力,进一步表明口蹄疫病毒O/CHN/Mya98/33-P株前导蛋白Lb56G或者(和)118R能够增强其抗宿主先天性免疫的能力。 本研究能够为进一步鉴定FMDV前导蛋白抗宿主先天性免疫的关键性位点奠定基础。