苜蓿多糖提取、纯化及其对蛋鸡肝细胞生物活性的影响

作     者：王少璞 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：佟建明

授予年度：2014年

学科分类：090502[农学-动物营养与饲料科学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：苜蓿多糖 优化提取 纯化 肝脏细胞 活性研究 

摘      要：本论文共包括三个试验。首先利用响应面试验设计对复合酶辅助提取苜蓿多糖技术进行了优化;然后通过柱层析技术纯化苜蓿多糖,并测定其分子量和单糖组成;最后,通过体外分离培养蛋鸡肝脏细胞,分别通过过氧化氢和混合脂肪酸溶液诱导建立肝细胞氧化应激模型和脂肪变性模型,研究苜蓿多糖对肝细胞氧化状态和脂肪代谢的影响。 试验一苜蓿多糖的提取工艺研究 通过响应面试验设计优化复合酶辅助提取苜蓿多糖的工艺以及苜蓿多糖体外抗氧化能力评价。首先利用单因素试验研究各个因素对苜蓿多糖提取率的影响。根据单因素试验结果,通过正交试验确定纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的最佳配比为2.5%,3.0%和2.0%;最后利用响应面设计优化提取温度、pH值、时间、液料比。结果表明,响应面模型的决定系数大于0.95,同时各因素显著影响苜蓿多糖的提取率(P0.05)。由该模型得到多糖提取的最佳条件为提取温度52.7℃、pH值3.87、液固比78.92mL/g、时间2.73h,多糖提取率为5.09%。在此条件下,进行3次验证试验,得到多糖提取率为5.05±0.02%,进一步证明该模型合适。体外清除自由基试验发现复合酶辅助提取的苜蓿多糖具有较好的抗氧化能力,并随多糖浓度的增加而增强。以上结果表明,苜蓿多糖可以作为一种天然抗氧化剂。 试验二苜蓿多糖的理化性质研究 本试验旨在对苜蓿多糖进行纯化和理化性质测定。利用Sevag法对苜蓿粗多糖进行脱蛋白处理,然后利用DEAE-纤维素和Sephadex G-100柱层析对苜蓿粗多糖进行分级纯化,得到四个纯化多糖组分：APS-2a, APS-2b, APS-3a和APS-3b。高效凝胶渗透色谱法分析各多糖组分(APS-2a, APS-2b, APS-3a和APS-3b)的分子量分别为48,536,6,221,66,559和13,076Da。高效毛细管电泳法分析各多糖组分的单糖组成发现,APS-3b的单糖组成最为复杂,单糖组成和摩尔比为木糖：阿拉伯糖：葡萄糖：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸=1.00：2.35:3.78:3.05：2.74：1.72：11.45。APS-3a的多糖和糖醛酸含量最高,分别为92.88%和52.09%。 试验三苜蓿多糖对蛋鸡肝细胞氧化状态和脂肪代谢的影响 本试验通过原位二步灌流法分离蛋鸡肝细胞,分别利用过氧化氢和混合脂肪酸(油酸：棕榈酸=2：1,培养基中的混合脂肪酸终浓度为1mM)诱导建立肝细胞氧化应激模型和脂肪变性模型。结果发现苜蓿多糖可以提高肝细胞的抗氧化酶(SOD、CAT)活性和总抗氧化能力,同时降低细胞培养液中的乳酸脱氢酶、丙二醛的含量。通过脂肪变性模型发现,苜蓿多糖可以降低肝细胞内甘油三酯的含量。以上结果表明苜蓿多糖通过提高肝细胞的抗氧化能力从而对肝细胞起到保护作用。苜蓿多糖可以降低肝细胞脂肪含量,调节肝脏脂肪代谢。