豚鼠气单胞菌鞭毛蛋白A基因的克隆与表达

作     者：秦玉广 

作者单位：山东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：安利国;杨桂文

授予年度：2009年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：豚鼠气单胞菌 细菌学 鞭毛蛋白A(FlaA)基因(flaA) 克隆与表达 

摘      要：本研究以上海海洋大学分离自患出血败血病的杂交鲟的豚鼠气单胞菌XL2-T为实验菌株,以三个不同地域、来源的豚鼠气单胞菌株为对照,对其进行了相关细菌学(Bacteriology)、病原学(Pathology)研究和(端生)单鞭毛(Single Polar flagella)蛋白A(flagellin A简称FlaA)基因(flaA)的克隆和原核与真核表达。为今后豚鼠气单胞菌亚单位基因工程疫苗开发和在水产上的应用进行了有益的探索。 参照相关文献,应用报道引物扩增了不同豚鼠气单胞菌flaA基因糖基化核心序列,经分析,近N端氨基酸序列均为NAQRNLM;近C端均为QANQRC极为保守,中间为糖基化可变区。查阅Genebank,将公布的相关豚鼠气单胞菌鞭毛基因应用megalign采用CLUSTAL“Wmethod进行alignment,设计简并引物,扩增得到flaA序列全长,构建了原核重组表达载体pET-28a+flaA和毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型重组表达载体pPIC9K+flaA。 将重组表达载体pET-28a+flaA转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达重组蛋白,并免疫新西兰兔制备抗血清,进行了效价测定及细菌凝集试验。 将重组pPIC9K+flaA应用限制性内切酶BglII和SacI,在不同位点线性化,采用电转化法转化毕赤酵母GS115,构建MutS和Mut+重组表达菌株。应用真核细胞诱导表达原核FlaA结构蛋白。 研究了豚鼠气单胞菌(Aromonas caviae)的适用培养基和培养条件及保存条件、菌落与细菌形态学、细菌生理生化鉴定、16SrDNA分子鉴定、运动性检测、相关毒力检测、药物敏感性检测,研究的侧重点为细菌鞭毛相关研究,包括鞭毛染色(silver stain和Lefison stain)、端生和侧生鞭毛(polar and lateral flagella)的提取,应用自制兔抗重组FlaA血清(anti-rcFlaA)进行了鞭毛蛋白(flagella)蛋白质印迹和不同来源豚鼠气单胞菌鞭毛提取液的免疫印迹,结果抗血清与不同来源的豚鼠气单胞菌的polar and lateral flagellin的蛋白质印迹均成交叉反应阳性,这说明今后如果以flaA为目的基因,开发基因工程疫苗将对不同来源的豚鼠气单胞菌都具有广谱免疫作用,这一结果进一步得到了应用anti-rcFlaA血清进行细菌凝集试验结果的支持。