丹东蒲公英NRAMP基因克隆及功能鉴定

作     者：刘晓敏 

作者单位：沈阳农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宁伟

授予年度：2018年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 10[医学] 

主      题：蒲公英 NRAMP Cd qRT-PCR 过表达 转运蛋白 

摘      要：丹东蒲公英(*** Kitag.)为菊科(Compositae)蒲公英属(Taraxacum ***.)多年生草本植物,20世纪60年代有学者提出蒲公英对重金属的富集作用在改良土壤方面有优势潜力(Mossop et al,2000)。为了探究蒲公英可以大量吸附重金属的原因和在吸附过程中相关的分子机理,本试验在丹东蒲公英转录组测序基础上,在NCBI数据库用Blast比对筛选出1条NRAMP基因序列,通过克隆得到Ta NRAMP基因,并运用软件进行生物信息学分析。再运用实时荧光定量PCR手段确定在Cd胁迫下Ta NRAMP基因的表达量变化。最后构建了PRI101-Ta NRAMP过表达载体,并通过农杆菌介导的方式转到丹东蒲公英中,来最终验证NRAMP基因的功能。试验结果如下:1.在丹东蒲公英中成功克隆到NRAMP基因,长1647 bp,编码548个氨基酸。Ta NRAMP氨基酸序列的保守结构域与拟南芥At NRAMP蛋白的相同,系统发育树结果显示与其亲缘关系最接近的是菊科植物向日葵;二级结构预测结果表明该蛋白由39.42%ɑ-螺旋,19.16%β-延伸和41.42%无规则卷曲三种模块组成。预测结果显示Ta NRAMP有10个的跨膜结构域,分别是在蛋白序列的12446、15981、19618、22547、26786、30729、36688、40825、47698、50325氨基酸位置。2.运用q RT-PCR对蒲公英的根、叶柄、叶和花4个组织进行Ta NRAMP基因的表达量分析,表明Ta NRAMP基因表达量在4个器官中差异性表达,基因在根中表达量最高,根中Ta NRAMP基因相对表达量约比花高出0.5倍,比叶片高出3倍,比叶柄高出31倍,呈现根花叶叶柄状态,呈显著性差异。3.在Cd胁迫处理下,Ta NRAMP基因的表达量随时间累加呈现很大的变化,在Cd处理0-2小时之间,Ta NRAMP基因的相对表达量呈逐渐稳定上调的趋势,并呈显著性差异。在处理2小时之后,Ta NRAMP基因的相对表达量开始急剧下降,下调幅度高达到20倍,在猛烈下降后逐渐开始保持稳定的低水平表达。在不同Cd处理时间,叶与根中基因相对表达量呈显著性差异。在处理24h和48h时,根中基因几乎不表达。4.成功构建PRI101-Ta NRAMP过表达载体,通过农杆菌介导方式转入到丹东蒲公英中,获得2株转基因植株。并对其进行0.5μm的Cd处理,与对照丹东蒲公英进行比较,发现转基因植株地上部分吸附重金属含量是对照的2-3倍,验证NRAMP基因在丹东蒲公英中对Cd吸附具有直接作用。