典型环境因子对硝化作用和氨氧化微生物生理生态的影响

作     者：郭佳 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蒋先军;贾仲君

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：淹水-落干 pH 氧气 硝化作用 氨氧化微生物 

摘      要：硝化作用是全球氮循环的重要环节,包括将氨氧化为亚硝酸的氨氧化过程以及亚硝态氮进一步氧化为硝态氮的亚硝化过程,而氨氧化过程是硝化作用的限速步骤,是硝化作用的研究重点。硝化作用主要由氨氧化微生物完成,环境因子通过改变氨氧化微生物的生理活性,进而影响硝化作用强度。有研究表明环境因子如铵浓度、温度、施肥处理、土壤类型、重金属胁迫、氧气和水分等变化,会对微生物种群数量、群落结构和活性产生影响,探究环境因子对氨氧化微生物的影响已成为近些年硝化作用研究的重点。水是生物生命存在和延续的基本物质,土壤水分变化必然对其微生物产生影响。淹水通常导致土壤有机质积累,氧化还原容量增加,土壤pH升高,土壤有机质与氧化还原容量与氨氧化古菌活性具有极佳的相关性。土壤pH是影响氨氧化微生物活性、群落结构和相对丰度的重要因素之一。一般认为自养氨氧化细菌最适生长pH为6.6-8.0或者更高,在中碱性土壤的研究中,大多研究表明其氨氧化作用主要有细菌主导。在低pH土壤中,自养氨氧化细菌的数量相对较少,活性较低,对底物氨分子更具亲和力的氨氧化古菌占优势地位。氧气是氨氧化反应的基质。动力学研究发现,氨氧化古菌对氧气的半饱和常数比细菌的低,古菌对氧气有更高的亲和力,在低氧环境中比氨氧化细菌更有竞争优势。海洋类古菌和土壤类古菌是氨氧化古菌的重要分支,研究它们之间的竞争关系及其对环境的适应对研究氨氧化古菌有重要意义。本研究采用普通PCR、实时荧光定量PCR、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、克隆文库构建及测序、454高通量测序等分子生物学技术,并结合稳定性同位素核酸标记示踪技术（DNA-SIP）等方法,深入探究典型环境因子（水分、pH、氧气）对硝化作用及其主导氨氧化微生物类群及其生理代谢特征的影响,揭示了典型环境因子（水分、pH、氧气）对土壤中氨氧化微生物的定向选择效应造成的生态位分异现象。本论文的主要研究内容和结论如下:本实验在重庆段万州、丰都和长寿3个典型消落带区域,分别采集淹水-落干8年、淹水-落干5年、未淹水对照土壤样品,通过室内培养、qPCR、DGGE分子指纹图谱和克隆文库技术研究土壤硝化活性以及氨氧化古菌和细菌的群落组成差异。结果表明万州、丰都和长寿3个消落带中,土壤有机质和p H含量随淹水-落干时间的增加而增加;除长寿消落带外,土壤硝化强度也随着淹水-落干时间的增加而增强;随着硝化作用的发生,氨氧化古菌和细菌数量呈上升趋势,DGGE条带数量、位置和亮度均发生明显变化;氨氧化功能基因amoA的系统发育分析表明:万州和丰都消落带氨氧化古菌均属于土壤类古菌Group 1.1b;而长寿消落带则检测到少量的海洋类古菌Group 1.1a;3个消落带的优势氨氧化细菌均属于Nitrosospira和Cluster 0类群。三峡库区独特的―冬蓄夏泄‖管理方式,导致淹水-落干8年的土壤经历了周期性的淹水-落干水分胁迫,提升了土壤有机质含量和pH,增加了土壤硝化作用强度,并可能改变了土壤氨氧化微生物群落结构。选择活性氨氧化古菌为海洋类古菌Group1.1a-associated的酸性森林土和活性氨氧化古菌为土壤类古菌Group 1.1b的碱性水稻土,等干重混合,调节混合土壤pH和氧气浓度;展开稳定性同位探针微宇宙室内培养实验,通过室内培养分析土壤硝化作用强度;利用qPCR和454高通量测序研究不同pH和氧气条件下土壤氨氧化古菌和细菌的数量变化规律和活性氨氧化微生物种类。结果表明,土壤混合后,低pH下没有硝化作用发生,而pH6.0和7.6发生了强烈硝化作用,且高氧环境下硝化作用强于低氧环境;加底物培养后,氨氧化古菌数量明显增加;活性氨氧化古菌几乎全为土壤类古菌Group 1.1b。说明p H而非氧气是影响硝化作用的主要因素,而氧气对硝化作用也有一定影响,土壤类古菌在中碱性土壤中的高氧和低氧环境有活性,比海洋类古菌具有更强的适应性。综上所述,我们对典型环境因子对土壤中的硝化作用及其主导微生物适应机制研究可归结为三个要点:（1）淹水-落干促进土壤硝化作用,并对氨氧化微生物群落结构产生影响;（2）p H对硝化作用的影响大于氧气（3）土壤类古菌在中碱性土壤中的高氧和低氧环境有活性,比海洋类古菌具有更强的适应性。