埃可病毒表面特异性抗原的表达及快速检测技术的建立

作     者：李素梅 

作者单位：南京医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李越希

授予年度：2016年

学科分类：1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：埃可病毒 VP1 蛋白纯化 多克隆抗体 胶体金免疫层析技术 

摘      要：人肠道致细胞病变孤儿病毒(Enteric Cytopathogenichuman Orphan Virus,ECHO),简称埃可病毒(E),是一类单股正链RNA的肠道病毒,有34个血清型。埃可病毒遍布世界各地,在人群中广泛传播和流行,可通过呼吸道和消化道传播,其感染可引起多种人类疾病,无菌性脑膜炎最为常见,同时,埃可病毒还会通过胎盘传播,孕妇感染可能造成胎儿畸形甚至死亡的严重后果。其中,埃可病毒1型、6型、9型研究最多,具有很强的感染性和致病性,由于它们日益增长的上升趋势和严重程度,值得受到广泛关注,并且亟需快速、有效的检测方法对其感染进行检测。目前,针对埃可病毒的检测方法主要包括病毒分离培养法、酶联免疫吸附试验、反转录PCR法。但是,这些方法存在的成本较高、需要特定设备、耗时长且需要对样品进行复杂的处理等缺陷,导致了它们的实际应用范围严重受限。所以,针对埃可病毒的检测方法的简便性、时效性有待提高,并且应该尽可能的节约检测成本,建立一种新的检测技术至关重要。胶体金免疫标记层析技术具有快速检测和现场应用的特点,不需要特殊设备和复杂工序,检测结果易于观察理解,是一种非常具有应用前景的诊断技术。在研究应用这种检测技术来检测埃可病毒的过程中,关键的问题就是找到一种理想的埃可病毒特异性抗原。埃可病毒VP1蛋白是埃可病毒重要的表面蛋白,几乎每一种埃可病毒的亚型都具有VP1表面蛋白,其与决定血清型的抗原决定因子密切相关,是病毒中和的主要决定因子,其保守性有利于疫苗开发,也为其作为检测试剂提供可行性和可能性。目前其全基因序列已经测定完毕,有利于进一步结合基因工程技术利用VP1蛋白研究开发诊断试剂和疫苗。本研究选用埃可病毒1型、6型、9型三种VP1表面蛋白作为研究对象。通过计算机软件对三种VP1的氨基酸序列进行分析,筛选抗原表位富集区,选用原核生物偏爱的密码子优化基因序列,化学合成优化的基因序列,分别克隆至pGEX-4T-2和pET-28a(+)两种质粒中,构建出六种重组表达载体,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选高表达菌株,通过亲和层析技术纯化六种VP1片段,分别是 E1-VP1-GST、E6-VP1-GST、E9-VP1-GST、E1-VP1-His、E6-VP1-His、E9-VP1-His。以三种带有His标签的VP1蛋白作为免疫原,免疫新西兰大白兔,纯化制备多克隆抗体,检测多抗效价。将纯化获得的三种带GST标签的蛋白作为标记抗原与胶体金偶联,并加到玻璃纤维膜上,将兔抗人多抗(IgG,IgM)和制备的多克隆抗体加到硝酸纤维素膜上,分别作为试剂条的检测线和质控线,结合双抗夹心法,组装出四种胶体金检测试纸条,包括三种单一亚型检测试纸条和一种混合型检测试纸条。用已制备的试纸条,检测不同稀释倍数的已知感染埃可病毒病人的阳性血清,证明检测最大的稀释倍数均为1:64,具有较好的灵敏度。对其他相近病毒感染的阳性血清进行检测,试纸条结果均为阴性,显示出较高的特异性。以传统的埃可病毒酶联免疫检测试剂盒作为金标准对照,两种方法检测结果并无统计学差异,制备的试纸条可在1Omin内看到结果,更简便、快速。试纸灵敏度、特异性、临床检测等均达到检测要求,其可大量检测的特点更适用于现场快速检测需要,具有重要的现实意义和极高的商业开发价值。