基于药物代谢酶的双参通冠方中延胡索与人参的相互作用研究

作     者：杨鑫宝 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘建勋

授予年度：2013年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：双参通冠方 延胡索 人参 化学成分 药物代谢酶 一氧化氮 

摘      要：背景：冠心病是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病,不同程度地影响患者的生活质量。“双参通冠方是本室研制的组分配伍复方中药,在组方筛选、药效、药理、药代动力学等方面进行了大量的研究工作。但在成药性方面还需深入研究,尤其是要明确是否存在潜在的药物相互作用,以保证用药安全。 目的： 1、为了获得足够量的目标化合物,从延胡索中分离纯化延胡索生物碱,从人参茎叶总皂苷中分离纯化人参皂苷。 2、根据FDA药物相互作用研究指南（草案）的原则,选择***2C19, CYP2D6和CYP3A4等5种CYP同工酶,研究“双参通冠方入血成分人参皂苷和延胡索生物碱对人肝药物代谢酶的抑制作用。 3、研究延胡索甲素的肝微粒体生物转化。 4、研究“双参通冠方入血成分人参皂苷和延胡索生物碱对一氧化氮生成的抑制作用。 方法： 1、采用溶剂法和色谱法分离纯化延胡索生物碱和人参皂苷,根据物化常数和各种谱学数据鉴定化合物结构。 2、将人肝微粒体与受试物（延胡索生物碱和人参皂苷）或阳性抑制剂与CYP探针底物孵育,用高效液相色谱-质谱联用法测定孵育液中特异性探针底物代谢产物的生成率,得到各同工酶的相对活性并计算相应的CYP同工酶的IC5。值,评价受试物对CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的潜在抑制作用。 3、采用NADPH再生系统,温孵液总体积为1000mL,内含大鼠肝微粒体100mL（以蛋白质计浓度为21.39mg/mL）,100niM PBS （pH7.4）,300mg延胡索甲素。在37℃水浴预温孵5min后,加入NADPH再生系统（1.0mM NADP,0.5mM NADH,10mM葡萄糖-6-磷酸盐,1000IU/mL葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶和4.0mM MgC12）启动反应,在37℃振荡器培养水浴中温孵2h,然后加入1000mL冰冷的EtOAc终止反应,取有机层：残留水层再用EtOAc萃取7次,合并萃取液,减压浓缩,N2吹仪吹干,得残渣2.8g。将其进行硅胶柱色谱和HPLC制备分离、纯化,得转化产物,根据NMR和MS数据鉴定转化产物结构。 对于转化分析,采用本实验室优化的大鼠肝微粒体温孵体系。温孵液总体积为500μL,包括5μL大鼠肝微粒体（以蛋白质计浓度为21.39mg/mL）或人肝微粒体（0.2mg/mL）,100mM PBS （pH7.4）,0.1μM延胡索甲素。在37℃水浴预温孵5min后,加入NADPH再生系统启动反应,在37℃振荡器培养水浴中温孵5、10、30min,然后加入100μL冰冷的终止液（甲醇-乙腈=1：4,含内标咖啡因）终止反应,在16000×g离心10min,取上清在温和的氮气流下吹干,残渣重悬于100μL的10%乙腈水溶液,过0.45μm微孔滤膜,取10μL续滤液进样LC-MS系统分析。 4、采用国际公认的脂多糖活化的BALB/c裸小鼠单核巨噬细胞RAW264.7释放一氧化氮（NO）模型,研究人参皂苷和延胡索生物碱对NO产生的抑制作用。由于NO的半衰期非常短,通过直接测定亚硝酸盐的聚集量代表NO的产生量。 结果： 1、从延胡索分离得到20个生物碱,根据物化常数和谱学数据分别鉴定为四氢黄连碱（1）、四氢非洲防己碱（2）、延胡索乙素（3）、紫堇球碱（4）、异紫堇球碱（5）、8-三氯甲基-7,8-二氢黄连碱（6）、延胡索甲素（7）、8-酮基黄连碱（8）、左旋紫堇根碱（9）、去氢延胡索甲素（10）、13-甲基巴马亭红碱（11）、氧化海罂粟碱（12）、原阿片碱（13）、降氧化北美黄连次碱（14）、四氢小檗碱（15）、二去氢海罂粟碱（16）、黄海罂粟灵碱（17）、黄连碱（18）、巴马亭（19）、小檗碱（20）。从人参茎叶总皂苷分离得到8个皂苷,根据物化常数和谱学数据分别鉴定为20S-人参皂苷Rg1（20S-ginsenoside Rg,,21）、人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb,,22）、人参皂苷Re（ginsenoside Re,23）、20S-人参皂苷Rh1（20S-ginsenoside Rh1,24）、20R-人参皂苷Rh1（20R-ginsenoside Rh1,25）、205-人参皂苷Rg2（20S-ginsenoside Rg2,26）、20R-人参皂苷Rg2（20R-ginsenoside Rg2,27）和人参皂苷Rd （ginsenoside Rd,28）. 2、在离体试验中,人参皂苷Rb1、Rd、Re和Rg1对人肝药物代谢酶亚型CYP1A2、 CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4活性无抑制作用,IC50值大于200μM。延胡索生物碱中,延胡索