核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大荧光生物传感器检测DNA

作     者：袁丹 

作者单位：湘潭大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈效兰

授予年度：2018年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 

主      题：核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ) 2-氨基嘌呤(2-AP) 金纳米簇(AuNCs) 硫磺素T(ThT) 荧光生物传感器 

摘      要：核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)对双链DNA有特定的水解作用,沿3’→5’的凹陷端方向逐步剪切单核苷酸,利用其剪切特性可以提高DNA传感器的灵敏度。脱氧核糖核苷酸(DNA)序列是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分,作为遗传指令,引导生物发育与生命机能运作,故而,在生物研究、临床诊断和生物应用等方面,核酸的检测尤为重要。近年来,发展起来的DNA荧光生物传感器具有易操作和高灵敏的优点,因此成为最广泛使用的检测方法之一。2-氨基嘌呤(2-aminopurine,2-AP)是一种腺嘌呤的类似物,与腺嘌呤互为同分异构体,拥有良好的荧光特性;金属纳米簇是一种新型的纳米材料,具有尺寸小、稳定性好、斯托克斯位移大、生物相容性好等优点,近年来被广泛地应用于生物、化学等领域;水溶性核酸染料硫黄素T(2-[4-(二甲基氨基)苯基]-3,6-二甲基苯并噻唑鎓氯化物,ThT)是一种特异性识别G-四联体DNA结构的染料。本论文基于核酸外切酶Ⅲ的水解作用,利用荧光基团2-氨基嘌呤(2-AP)、金纳米簇(AuNCs)以及核酸染料硫磺素T(ThT)物质的光谱特性构建了几种新型荧光生物传感器用于DNA的检测。具体研究包括了以下内容:(1)基于核酸外切酶Ⅲ和2-氨基嘌呤(2-AP)荧光探针快速检测p53突变基因。首先设计一条2-AP标记的探针DNA(cDNA)及与其部分互补的DNA(bDNA),形成cDNA/bDNA双链传感器。当加入目标DNA(tDNA)后,发生链置换形成更加稳定的3’端平末端的cDNA/tDNA双链DNA,此双链DNA在Exo Ⅲ的水解作用下,释放出tDNA且不断产生游离的2-AP。释放出来的tDNA诱发新一轮的酶水解反应,使反应体系荧光信号强度不断增强,从而实现体系荧光信号放大。p53浓度在1.0-850 nM范围内与体系荧光的变化值(△F)具有良好的线性关系,检出限为104 pM。该方法具有分析快速,操作简单,高选择性和检出限低等特点。(2)基于核酸外切酶Ⅲ以DNA为模板的金纳米簇荧光传感器检测HIV-1。通过利用DNA为模板合成金纳米簇,构建DNA-AuNCs荧光探针,利用Exo Ⅲ对双链DNA的剪切特性,一方面Exo Ⅲ能剪切HIV-1与其部分互补的DNA杂交形成的双链DNA,从而实现HIV-1的循环,达到提高灵敏度的目的;另一方面在Exo Ⅲ的作用下,不断产生与DNA-AuNCs荧光探针互补的增强其信号的DNA序列(G-DNA),从而实现体系荧光信号的放大,根据体系荧光信号的变化(△F)来检测HIV-1 DNA。实验表明在1.0-400 nM范围内△F与HIV-1浓度的对数呈线性,检出限为154 pM。该方法简便,低成本,高灵敏,特异性好,可用于实际样品检测。(3)基于核酸外切酶Ⅲ链式放大技术荧光比色法高灵敏检测HBV。当HBV(tDNA)存在时,tDNA相继打开两个发夹DNA(HP1、HP2),形成3,端平末端的HBV-HP1-HP2双链结构。在Exo Ⅲ的作用下,分别释放出tDNA、HP2部分互补的DNA(pDNA)及能形成G-四联体的DNA(G-DNA)。tDNA与pDNA分别参与Ⅰ,Ⅱ循环,在循环Ⅰ和循环Ⅱ自发进行的基础上,实现循环放大。当核酸外切酶Ⅲ协助的循环完成,释放的G-DNA可分别与硫磺素T(ThT)和氯化血红素(Hemin)结合形成G-四联体复合物。其中ThT/G-四联体可以产生明显增强的荧光信号,而Hemin/G-四联体在双氧水存在下,可以催化氧化ABTS2-,使溶液颜色明显改变,测其紫外可见吸收光谱。据此,可以用荧光法、比色法和紫外可见光谱法检测HBV。其中,荧光法的灵敏度最高,在0.2-50 nM范围内AF与HBV的浓度呈线性,检出限为54pM。