VEGF/VEGFR在洛克沙胂促内皮细胞生长中的调节作用

作     者：辛文芳 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张雨梅

授予年度：2014年

学科分类：090502[农学-动物营养与饲料科学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：洛克沙胂 内皮细胞 VEGF VEGFR Western blot 荧光定量PCR 

摘      要：洛克沙胂(Rox)是在世界范围内广泛使用的一种含砷饲料添加剂,对促进养殖业的发展起了很大作用。Rox促进动物生长的机制至今并不完全清楚,可能与增强细胞生长、免疫及能量代谢相关基因的表达有关,也可能与促进血管生长、增加血管通透性有关。目前国内外对这方面的研究甚少。本实验室在体内体外对Rox促血管作用进行了相关研究,在此基础上,本文通过阻断VEGF及其受体KDR/FLT-1,经MTT法、细胞免疫荧光、Elisa法、Western blot、实时荧光定量PCR,研究Rox促内皮细胞生长作用中VEGF/VEGFR的作用,增加对Rox促血管生成作用VEGF机制的认识,为Rox作为畜禽饲料添加剂使用的安全性评价,以及为有机胂残留潜在的促(致)癌风险评估提供理论依据。 大鼠内皮细胞经不同处理12、24、36、48h后,MTT法检测细胞活力;Elisa法测定细胞培养液中的VEGF水平;细胞免疫荧光、Western blot及定量PCR检测细胞中VEGF、 VEGFR (KDR/FLT-1)的表达。不同处理剂量组共11组,分别为PBS阴性对照组(阴)、10ng/mL VEGF阳性对照组(阳)、Rox0.1μM、1.0μM、10.0μM、100.0μM、10ng/mL Anti FLT-1、Anti KDR、Anti VEGF、Rox1.00μM+10ng/mL Anti KDR(Roxl+Anti KDR)、Rox1.00μM+10ng/mL Anti FLT-1(Rox1+Anti FLT-1)。 MTT法检测细胞活力的结果表明,Rox0.1～100.0μM,阳性对照组细胞活力显著高于PBS (P0.05);Rox1μM+Anti KDR组显著低于1.0μM组(P0.05)。结果表明VEGF、KDR在Rox促内皮细胞生长作用中具有调节作用。 细胞免疫荧光分析可以观察到Rox处理的内皮细胞中VEGF、KDR、FLT-1均有表达。Elisa检测细胞培养上清中VEGF的含量,结果显示Rox各剂量组均显著高于阴性对照组、且1.0μM Rox组分泌量最高;阻断剂组：Anti KDR组显著高于阴性对照组(P0.05)。表明Rox刺激内皮细胞分泌VEGF,阻断KDR后培养液中的VEGF显著升高,而阻断FLT-1则无明显作用。Western blot检测内皮细胞中VEGF、KDR、FLT-1的蛋白表达,结果表明：Rox各剂量组的蛋白表达均高于阴性对照组,且1.0μMRox组表达水平最高;加入VEGF、KDR抗体阻断后VEGF、KDR的表达相应减少,与阴性对照组有显著性差异,而加入FLT-1阻断剂后FLT-1的表达水平与阴性对照组无显著性差异(P0.05);Rox1+Anti KDR组显著高于AntiKDR组,显著低于1.0μM Rox组,而Rox1+Anti FLT-1组显著高于Anti FLT-1组,与1.0μM Rox组无显著性差异。 荧光定量PCR从基因水平上检测Rox各个剂量组及加入阻断剂后VEGF、KDR和FLT-1的mRNA表达水平。结果表明：Rox各剂量组的VEGF、KDR的mRNA表达均高于阴性对照组,且1.0μMRox组表达水平最高;加入VEGF、KDR阻断剂后VEGF、KDR的mRNA表达相应减小;Rox1+Anti KDR组显著高于Anti KDR组,显著低于1.0μM Rox组,而Rox1+AntiFLT-1组显著高于Anti FLT-1组,与1.0μM Rox组无显著性差异。 综上所述,0.1-100.0μM Rox对内皮细胞具有明显的促生长作用,1.0μMRox作用最强,VEGF/KDR在Rox促内皮细胞生长中起重要调节作用。