类受体蛋白激酶在水稻抽穗期的表达及作用机制研究

作     者：李颖秀 

作者单位：山东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘炜

授予年度：2018年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：水稻 类受体蛋白激酶 启动子 穗发育 表达模式 蛋白表达及纯化 激酶活力测定 亚细胞定位 酵母双杂交 

摘      要：类受体蛋白激酶(RLKs)通过磷酸化与去磷酸化反应,将胞外信号传递至胞内,在植物体生长发育、抗病、防御等方面作用重大。前期研究中,在水稻数据库中检索获得多个与水稻发育相关的RLKs,进一步结合Rice eFP Browser网站中基因数字表达谱数据,筛选到六个在穗发育时期特异表达的RLKs,分别将其命名为FTPK1(Flower Time Protein Kinase1,OsRLK800)、OsRLK890、OsRLK940、OsRLK040、OsRLK100、OsRLK320。应用荧光定量对RLKs组织表达模式分析显示,六个RLKs在水稻茎顶端分生组织过渡到穗发育及分化的过程中表达量均显著升高,且变化趋势与数字表达谱的结果一致,尤其是FTPK1和Os RLK940在抽穗中期和灌浆后期的相对表达量达到营养生长期的8倍和14倍左右;OSRLK890在穗发育各个时期的表达量虽略有升高,但各时期差异不明显。生物信息学分析显示,以上六个RLKs基因的启动子区均包含数个与发育相关的顺式作用元件,且FTPK1的启动子序列中,含有调控PAL基因的表达及参与植物抗病抗逆调节的GTGANTG10元件高达12个;含有与植物抗病及生长调控有关的W BOX元件7个;预测该类启动子所调控的基因可能参与水稻穗发育过程。六个RLKs的蛋白结构域预测显示,大部分蛋白结构中均包含一个B lectin保守结构域和两个跨膜结构域,推测它们具有相似的生物学功能。为深入研究RLKs基因在植物体内的功能,本研究构建了pCAMBIA1301P-FTPK1、pCAMBIA1301P-OsRLK940、pCAMBIA1301P-OsRLK890植物双元表达载体,借助农杆菌侵染转化水稻愈伤组织。经GUS组织化学染色及PCR分子检测,获得FTPK1正义表达株系12株,OsRLK940正义表达株系2株,OsRLK890正义表达株系1株,并将收获的种子进行南繁,进一步筛选转基因植株纯系材料,并拟以“中花11为对照,对转基因株系进行高通量测序及基因表达谱分析,为解析该类激酶作用途径、构建基因调控网络提供线索。为解析RLKs在植物发育中的作用机制,文中重点对FTPK1的理化特性进行研究。构建了pET28a-FTPK1原核表达载体,并对其诱导表达的融合蛋白的磷酸激酶活性进行了体外鉴定。为明确FTPK1在细胞内的定位情况,构建了带有GFP报告基因的pCAMBIA2300GFP-FTPK1亚细胞定位载体,用拟南芥原生质体瞬时表达系统进行研究,结果显示该基因定位于细胞质和细胞核,推测FTPK1可能在胞外信号向胞质及细胞核的传输过程中发挥功能。同时应用酵母双杂交系统对FTPK1的互作蛋白进行了筛选,以水稻抽穗前期和中期幼穗为材料构建酵母双杂交cDNA文库,构建FTPK1酵母双杂交诱饵载体,在3-AT浓度为0mM的四缺平板上筛库,经过LacZ显色反应初步获得166个菌落,经PCR检测及测序后得到25个可能与FTPK1互作的蛋白。挑选其中4个与发育相关的蛋白构建文库载体,对其与FTPK1蛋白互作情况进行验证,得到两个可能与FTPK1蛋白发生互作的蛋白,为完善FTPK1基因上下游信号通路、分析FTPK1在水稻穗发育时期的作用机制提供线索。本研究对解析RLKs在植物发育过程中的功能,完善并构建RLKs的调控网络奠定了基础。